原发性肝癌组织及细胞系中DNMT mRNA表达的检测及意义

高 波，李海平，余宗涛，吕 军，张吉才

(湖北医药学院附属太和医院检验科，湖北 十堰 442000)

我们既往的研究发现原发性肝癌组织中p16基因发生甲基化的频率非常高，并且通过分组发现乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染相关肝癌的p16基因甲基化的频率要高于非HBV相关肝癌，提示HBV的持续感染对p16基因的异常甲基化有一定作用，但其作用机制尚不明确[1-3]。基因的异常甲基化可能与多种因素有关，包括甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)水平、致癌物接触、基因修复缺陷等，其中DNMT是调节甲基化的主要因素。为了解HBV感染与DNMT表达之间的关系，本研究采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测44例原发性肝癌组织和HBV相关肝癌细胞系Hep3B、非HBV相关肝癌细胞系HepG2中4 种 DNMT mRNA(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B)的表达情况，初步探讨DNMT mRNA表达改变与HBV感染及肝癌等的关系。

材料和方法

一、临床资料

收集太和医院2010年12月1日至2012年2月1日的肝癌患者术后新鲜癌组织标本44例，患者男35例，女9例。所有组织标本均经病理学确诊，临床资料完整。组织标本收集后液氮中保存备用。根据患者血清中HBV标志物的存在与否，将癌组织分为2组。HBV相关性肝癌组:共32例，患者血液标本中至少检测出一种HBV感染的标志物，HBsAg、HBeAg、抗 HBe、抗 HBc 或 HBV DNA;非HBV相关性肝癌组:血液标本中未检测出任何一种HBV感染标志物，共12例。

二、细胞及主要仪器试剂

肝癌细胞系Hep3B和HepG2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，来自于美国标准生物品收藏中心;细胞培养基DMEM、小牛血清均购于GIBCO公司;Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Promege公司);PCR试剂(上海生工公司);PCR仪PE7500(ABI公司);SYBR GreenⅠ染料(Gene公司);G-BOX紫外凝胶成像系统(Gene公司);ND-2000微量核酸定量仪(美国NanoDrop公司);150 bp DNA mark(上海生工公司);DNA mark(北京天根公司);TG-16WS台式高速冷冻离心机(日立公司)。

三、方法

1.PCR引物设计与合成 DNMT1:5'-CGACTACATCAAAGGCAGCAACCTG-3'，5'-TGGAGTGGACTTGTGGGTGTTCTC-3'，扩增产物 166 bp;DNMT2:5'-AAGCTGTAAGCCAGCCCATATAC-3'，5'-TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG-3'，扩增产物148 bp;DNMT3A:5'-CGAGTCCAACCCTGTGATGATTG-3'，5'-GCTGGTCTTTGCCCTGCTTTATG-3'，扩增产物221 bp;DNMT3B:5'-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3'，5'-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3'，扩增产物 152 bp;GAPDH:5'-GAAGGTGAAGTCGGAGTC-3'，5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，扩增产物226 bp。所有引物合成由北京赛百盛公司完成。

2.细胞培养 人肝癌细胞株HepG2(HBsAg阴性)和Hep3B(HBV阳性)待复苏后培养于含100 mL/L小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的 DMEM培养液，培养在6孔培养板中，置于5%CO2的37℃的细胞培养箱，每3～4天消化传代1次。培养结束时，先把培养液抽干，加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化细胞，置于37℃ 2 min后收集细胞，再以磷酸盐缓冲液洗涤细胞备用。

3.癌组织及细胞总RNA提取 参照Trizol说明书提取细胞中总RNA。

4.逆转录 参照试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。

5.PCR扩增 按试剂盒要求操作。反应条件:95℃ 预变性3 min;95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃1 min，共40个循环;最后一循环于72℃ 5 min。

6.结果判断 基因相对定量方法:利用检测得到的Ct值和计算得到的扩增效率，以参比基因(GAPDH)为内参，计算mRNA的相对表达量。R=Test mRNA/参比 mRNA=(1+E参比)Ct(参比)/(1+E)Ct(test)test

四、统计学方法

应用SPSS13.0统计软件进行结果分析，计量资料经检验符合正态分布的，采用表示，采用两独立样本t检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、DNMT mRNA实时荧光定量PCR的建立

2种肝癌细胞系重复5次培养，收集细胞后提取总RNA，待浓度和纯度符合要求后进行逆转录及PCR扩增，最后进行各个基因表达检测，基因表达的结果用表示。检测4种DNMT mRNA实时荧光定量PCR均具有比较好的特异性，熔点曲线见图1。

二、4种DNMT mRNA在肝癌细胞系Hep3B与HepG2中的表达

Hep3B细胞系中 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达高于 HepG2细胞系(P＜0.01)。见表1。

三、原发性肝癌患者肝癌组织DNMT mRNA表达的分析

HBV感染相关癌组织中 DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平明显高于非HBV感染相关癌组织(P＜0.05)。见表2。

图1 DNMT和GAPDH的熔点曲线

表1 2株肝癌细胞系中DNMT mRNA的表达 (R)

表2 肝癌组织中DNMT mRNA的表达分析

讨 论

至今发现的DNMT至少有4种亚型，分别为:DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和 DNMT3B，主要功能是维持甲基化和全程甲基化。甲基化是在DNMT的催化作用下加到C上形成mC[4]，从理论上讲应与DNMT的结构和/或活性异常有关。DNMT1的主要功能是保证新合成的DNA具有高度的保真性，并且维持甲基化转移酶的功能[5]。DNMT2的作用目前尚不明确，可能与着丝粒区域的甲基化控制有关。DNMT3A和DNMT3B在原始胚胎形成中起重要的作用，主要功能是催化DNA甲基化的新生位点。正常细胞DNMT1的过度表达可导致CpG岛超甲基化，促进细胞转化。有研究表明，部分肿瘤细胞的DNMT水平表达明显高于正常细胞，并且与某些抑癌基因的超甲基化状态相关[6]。在细胞周期中不同的 DNMT mRNA可能受不同的调节机制调控，异常的DNMT表达可引起甲基化改变，且DNMT功能改变可引起异常甲基化或正常甲基化模式的丢失，导致DNA甲基化模式的转换。与DNMT相关的因素可能有:(1)与DNMT1忠诚性有关;(2)与 DNMT3A和DNMT3B的错误靶向有关;(3)与错误的甲基化修复机制有关;(4)与DNMT的活性异常有关;(5)与染色质构型重塑(chromatin remodeling)有关。

HBV感染与肝癌之间的关系十分密切，流行病学调查发现肝癌患者 HBsAg阳性率可达90%[7]。国内外的研究也表明持续的HBV感染所导致的部分抑癌基因甲基化是肝癌发生、发展过程中的早期事件[3，8-9]。虽然持续的HBV感染可以导致部分抑癌基因的甲基化发生，但是这其中的机制尚不明确。本研究采用定量PCR检测HBV相关性与非HBV相关性肝癌细胞系中4种DNMT mRNA表达水平的变化，探讨HBV感染是否对一种或多种DNMT mRNA的表达水平产生影响。

在本结果中发现HBV感染肝癌组织和非HBV感染肝癌组织间DNMT mRNA表达水平不同。HBV感染相关肝癌组织中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织，还发现可分泌HBsAg的Hep3B细胞这3种 DNMT mRNA表达也高于 HBsAg阴性的HepG2细胞。上述试验结果表明HBV的病毒组分可以剌激受染细胞DNMT mRNA的表达，进而促进抑癌基因的甲基化。甲基化酶的表达异常改变可能与基因异常甲基化和肿瘤形成有关，在多种肿瘤中均可见DNMT mRNA的过度表达。国内许军等[10]在研究人肝癌细胞株、人正常肝细胞株及癌旁细胞株中DNMT3B的表达发现，肝癌细胞株中DNMT3B mRNA的表达要明显高于正常和癌旁细胞株，提示DNMT3B的高表达可能与肝癌的发生相关。

病毒感染与DNMT之间的这种关系并不只存在于肝癌细胞中。有研究表明除HBV外的其他病毒及其组分也可通过激活DNMT的活性从而进一步使抑癌基因的表达下降。Tsai等[11]在培养的鼻咽癌细胞系中发现，经过EB病毒感染的癌基因产物(LMP-1)能够诱导 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，进而使E-cadherin基因发生甲基化。EB病毒是胃癌发生的一个潜在危险因子，研究发现，在胃癌发生过程中，DNMT1的高表达与 h-MLH、thrombospondin-1、E-cadherin等基因启动子甲基化和CpG岛甲基化表型相关，并且这些基因的甲基化均与EB病毒感染有关[12]。HB病毒感染、DNMT活性改变、基因甲基化都是肝癌形成的早期事件，那么从某种程度上讲，三者具有潜在的关联，HBV感染作为肝癌形成的一个外部生物因子，可能通过刺激DNMT基因的表达，进而促进抑癌基因甲基化而参与肝癌形成，这也为了解肝癌的发生机制提供了一个新的思路。

[1]Jicai Z，Zongtao Y，Jun L，et.al.Persistent infection of hepatitis B virus is involved in high rate of p16 methylation in hepatocellular carcinoma[J].Mol Carcinog，2006，45(7):530-536.

[2]张吉才，吕 军，李海平，等.血浆p16启动子异常甲基化在肝癌诊断中的应用价值[J].中华检验医学杂志，2006，29(10):895-898.

[3]张吉才，余宗涛，吕 军，等.HBV感染与肝癌组织CDKN2A基因甲基化关系的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2006，13(12):892-895.

[4]M ed in a-F ran co JL，Cau lfield T.Ad van ces in th e computational development of DNA methyltransferase inhibitors[J].Drug Discov Today，2011，16(9-10):418-425.

[5]Qin W，Leonhardt H，Pichler G.Regulation of DNA methyltransferase 1 by interactions and modifications[J].Nucleus，2011，2(5):392-402.

[6]Fang JY，Lu R，Mikovits JA，et al.Regulation of hMSH2 and hMLH1 expression in the human colon cancer cell line SW1116 by DNA methyltransferase 1[J].Cancer Lett，2006，233(1):124-130.

[7]陆再英.内科学[M].北京:人民卫生出版社，2008:467.

[8]Lai HJ，Lo SJ.Epigenetic methylation of TIMP-3 may play a role in HBV-associated hepatocellular carcinoma[J].Chang Gung Med J，2005，28(7):453-455.

[9]Lambert MP，Paliwal A，Vaissière T，et al.Aberrant DNA methylation distinguishes hepatocellular carcinoma associated with HBV and HCV infection and alcohol intake[J].J Hepatol，2011，54(4):705-715.

[10]许 军，樊 红，赵主江，等.RNAi及DNA芯片分析肝癌细胞系中受DNMT3B调控的下游基因[J].遗传学报，2005，32(11):1115-1127.

[11]Tsai CN，Tsai CL，Tse KP，et al.The Epstein-Barr virus oncogene product，latent membrane protein 1，induces the downregulation of E-cadherin gene expression via activation of DNA methyltransferases[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(15):10084-10089.

[12]Etoh T，Kanai Y，Ushijima S，et al.Increased DNA methyltransferase 1(DNMT1)protein expression correlates significantly with poorer tumor differentiation and frequent DNA hypermethylation of multiple CpG islands in gastric cancers[J].Am J Pathol，2004，164(2):689-699.