亚硒酸钠联合长春新碱对HT-29结肠癌细胞的影响

唐士超 周达岸

结肠癌是一种常见的肿瘤疾病，严重威胁着人类的健康，但其发病机制不清，目前仍无有效治疗手段。微量元素硒与肿瘤发生关系密切，结肠癌患者体内常缺乏含硒化合物［1］，硒缺乏可能是结肠癌发生的重要机制之一。长春新碱在结肠癌的治疗过程中发挥了重要作用，但副作用较为明显，在一定程度上限制了其临床应用，积极探索长春新碱的配伍用药，减少其用量具有重要临床意义。因此，本文拟探讨亚硒酸钠与长春新碱联合用药对结肠癌细胞HT-29的影响及机制，以期为结肠癌的临床用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 HT-29结肠癌细胞株(中科院上海细胞库)，DMEM培养基及胎牛血清(Gibco公司)，噻唑蓝(MTT，南京建成生物工程研究所)，Cyclin D1蛋白抗体(Santa公司)，酶标仪(北京普郎克公司)。

1.2 实验分组 以1×104/孔的密度将HT-29细胞接种于96孔板内分组培养，对照组不添加处理因素(MDEM培养基+10%胎牛血清)，亚硒酸钠组含10 μmol/L亚硒酸钠，长春新碱组含40 μg/L长春新碱，联合给药组含10 μmol/L亚硒酸钠及40 μg/L长春新碱。

1.3 MTT法检测 HT-29细胞存活率 分组培养24、48、72 h后，换无血清培养基培养4 h，96孔板每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，4 h后弃去培养液加入150 μl二甲亚砜并振荡15 min，酶标仪490 nm波长检测各孔吸光度(A值)，细胞活力=检测组A值/对照组A值×100%。

1.4 Western-blot检测 Cyclin D1蛋白表达 根据MTT实验结果，检测细胞活力降低明显时HT-29细胞Cyclin D1蛋白表达。粉碎细胞后4℃ 12000 r/min离心15 min，测定并调节上清蛋白浓度，SDS-PAGE电泳蛋白并转移至PVDF膜，以Cyclin D1蛋白及β-actin一抗室温下分别孵育2 h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，利用ECL发光试剂盒显影。以β-actin为内对照，观察Cyclin D1蛋白表达变化。

2 结果

2.1 亚硒酸钠及长春新碱对HT-29细胞活力的影响 MTT实验显示，亚硒酸钠及长春新碱均可抑制HT-29细胞活力，联合用药效果更为显著。分组72 h后HT-29结肠癌存活率降低最为显著，因此本研究检测了分组72 h后Cyclin D1蛋白表达变化(表1)。

表1 亚硒酸钠及长春新碱对HT-29细胞活力的影响(n=6/组)

2.2 亚硒酸钠及长春新碱对HT-29细胞Cyclin D1蛋白表达的影响 Western blot检测显示，亚硒酸钠及长春新碱均可下调HT-29细胞Cyclin D1蛋白表达，且联合用药Cyclin D1蛋白表达降低更为明显(图1)。

图1 Cyclin D1蛋白表达变化

3 讨论

结肠癌是一种临床常见病多发病，在40～50岁年龄组发病率为高，结肠癌患者体内硒元素含量常明显降低［1］，补充硒可以有效降低大鼠及小鼠的皮肤癌、乳腺癌、肝癌及结肠癌的发生率［2］，但其机制尚不完全清楚。Cyclin D1是一种细胞周期蛋白，与细胞增殖分化关系密切，可促进细胞生长分裂Cyclin D1蛋白表达上调是癌细胞永生化的重要机制之一。研究发现，大肠癌组织中Cyclin D1蛋白表达明显上调［3］，且直结肠癌细胞HCT116和SW480中Cyclin D1也有表示上调表现［4］。本研究显示，HT-29人结肠癌细胞中Cyclin D1蛋白大量表达，给予亚硒酸钠可明显抑制HT-29结肠癌细胞Cylin D1表达，并抑制HT-29细胞活力。研究结果提示Cylin D1表达上调是HT-29细胞增殖分化的重要机制之一，下调Cylin D1表达可能是亚硒酸钠降低HT-29细胞活力的重要机制之一。

长春新碱是一种从长春花中提取的生物碱，抗肿瘤作用已获得广泛认可，但其毒副作用较强，对神经系统的毒副作用尤为明显，且长期使用易产生耐药性，因而限制了其临床应用。本研究表明，长春新碱可明显抑制HT-29结肠癌细胞活力，下调Cyclin D1蛋白表达。结果提示长春新碱可通过下调Cyclin D1抑制HT-29细胞活力。长春新碱与亚硒酸钠联合给药对HT-29结肠癌细胞Cyclin D1表达抑制作用更为明显，对细胞活力抑制也更为显著，提示二者联合给药可提高抗肿瘤作用，为结肠癌的临床治疗提供了理论依据。

［1］郁宝铭，王敏，许叔祥，等.大肠癌患者硒与免疫功能关系的研究.上海第二医科大学学报，1996，34(1):50-53.

［2］杜明，王聪，张兰威，等.硒的生物学功能及其补充剂的研究现状.生物信息学，2007，5(4):176-178.

［3］金锦莲，张端莲，谈新提.应用组织芯片检测大肠癌组织中p27和cyclin D1的表达及意义.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21(2):113-117.

［4］罗慧，杨洋，许彩民.亚硒酸钠对结直肠癌HCT116和SW480细胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表达的影响.中国医学科学院学报，2011，33(6):654-658.