癌-睾丸抗原S S X基因在肝细胞癌中mRNA水平的表达及意义

肖瑞雪 农蔚霞 宋 琼 陈 芳 何少健

广西医科大学组织胚胎学教研室，广西南宁 530021

癌-睾丸抗原（cancer-testisantigen，CTA）是一类限制性表达于正常睾丸和肿瘤的抗原，它曾被认为与癌的发生有关。近几年来，CTA 被看作是癌症免疫疗法的理想靶点而倍受关注[1]。CTA的编码基因通过诱导人体的免疫细胞引起特殊的体液免疫和细胞免疫反应。已有报道指出，CTA 家族中某些基因已经用于肿瘤的分子诊断和免疫治疗[2]。

滑膜肉瘤X 断裂点基因 （synovial sarcoma，X breakpoint gene），又称SSX 基因，是多个成员的基因家族，它们均位于X 染色体p11.23～p11.22 位，作为CTA 家族成员之一，其只在睾丸、胎盘等具有血液屏障的正常组织中表达。对SSX 基因序列和功能研究发现，SSX 基因表达产物的主要功能为转录抑制。SSX 基因编码的蛋白有两个功能区：SSX-KRAB 区（SSX-related kruppel associated box domain）和 SSX-RD 区（SSX-repression domain）[3]，而 SSX-KRAB 区的结构域所编码的蛋白又隶属于KRAB-锌指蛋白亚群但其抑制转录的功能微弱，甚至是无效的；另一功能区SSXRD 功能发挥是通过对核内染色质进行修饰而达到抑制转录作用[4]。

Tureci 等[5]在325 份不同组织来源的肿瘤样品中分析SSX1-5 基因家族mRNA的表达情况时发现，除SSX-3 以外其余4 种基因至少有一种基因在肿瘤样品中有表达。Ayyoub 等[6]对6 种不同组织类型的10个滑膜肉瘤细胞系进行SSX1～5 基因mRNA 表达调查发现，两种以上基因同时表达的占60%，全部肿瘤细胞至少表达一种上述基因。Naka 等[7]在研究骨肉瘤SSX 基因表达情况时发现，17个患者标本中有16个患者的标本至少表达SSX1～5 基因中的一种。综合上述，SSX 基因家族在肿瘤患者中mRNA的表达情况发现，整个SSX 基因家族在癌组织中处在相对较高的表达频率，而且也存在基因共同表达情况。因此，研究针对SSX 基因家族不同成员均有作用的抗原表位，势必可以提高基于SSX 基因家族肿瘤免疫治疗的应用价值。

本研究采用RT-PCR 方法，针对肝癌组织和肝癌细胞株中SSX 基因家族mRNA 表达和共表达情况进行深入研究，为基于SSX 基因家族的肿瘤免疫治疗和多价疫苗的研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌细胞株Bel-7404 购自上海细胞所，肝癌细胞株HePG2 由广西医科大学微生物学专业宋德志老师惠赠，肝癌细胞株7721 来自广西医科大学组织胚胎学实验室培养传代，正常细胞株（阴性对照）7702 由广西医科大学实验中心蔡新老师惠赠。

收集2009年2月～2010年10月于广西医科大学第一附属医院肝胆外科和肝移植科住院患者的外科手术切取组织。组织标本包括28例肝细胞癌及癌旁组织，3例肝硬化组织。标本的临床分期依据1977年全国肝癌防治协作会议TNM分期标准。28例肝癌组织中包括11例结节型肝癌，13例巨块型肝癌，4例弥漫型肝癌，其中14例处于TNM分期的Ⅰ～Ⅲ期，14例处于Ⅳ期。患者年龄22～86岁，平均50岁，其中，男24例，女4例。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养采用RPMI 1640 培养基 （包括10%胎牛血清，100 μ/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素）于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 总RNA 提取将手术后切取的肝癌组织和癌旁组织迅速放入液氮中，然后尽快转移至-80℃冰箱内。用Trizol试剂（上海宝生物公司）提取组织和细胞中的总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280值，1%琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性。取500 ng 总RNA，用RT-PCR 试剂盒DRR019A（TAKARA公司）合成cDNA，反应条件和反应体系参考试剂盒说明书。

1.2.3 半定量 RT-PCR 检测 SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA表达 采用RT-PCR 法检测SSX1、SSX-2、SSX-3 mRNA 表达。所用引物及扩增片段如下，SSX-1（422 bp）上游引物：5'-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC-3'，下游引物：5'-AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA-3'；SSX-2 （435bp）上游引物：5'-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3'，下游引 物 ：5'-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3'；SSX-3 （378 bp）上游引物：5'-GGAAGAGTG GGAAAAGATGAAAGT-3'，下游引物：5'-CCCCTTTTG GGTCCAGATATCA-3'；内参p53（763 bp）上游引物：5'-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3'， 下游引物：5'-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3'。PCR 反应条件：SSX-1 为56℃退火30 s，扩增40个循环；SSX-2 为 54℃退火 30 s，扩增 40个循环；SSX-3 为61℃退火30 s，扩增40个循环；内参p53 为65℃退火40 s，扩增35个循环。随机选取每个基因中6个阳性表达的PCR 产物进行DNA 序列测定。PCR 引物的合成由上海捷瑞公司进行，产物的纯化和序列测定由北京诺赛公司完成。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用 χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 测序结果

随机抽取的阳性表达PCR 产物进行DNA 测序，所得序列与基因库检索序列一致，证实所扩增产物为目的基因的片段。

2.2 SSX mRNA 在肝癌细胞株的表达

在肝癌细胞株 7404、HePG2、7721 中，SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA的表达不同，但是在每一种细胞株中至少有一种基因表达。 在 7404（图 1）中，有 SSX-1（422 bp）和SSX-3（378 bp）表达；在 HePG2（图 2）中，有 SSX-2（435bp）和 SSX-3（378 bp）表达；在 7721（图 3）中，只有 SSX-3（378 bp）表达。 p53（763bp）作为内参，均有表达。

2.3 SSX mRNA 在肝癌及癌旁组织中的表达

SSX 基因在癌旁组织和肝硬化组织中均不表达。在肝癌组织中，SSX-1、SSX-2、SSX-3的表达阳性率分别为53.6%、35.7%、57.1%。 p53（763 bp）作为内参，均有表达。 见图4。

2.4 SSX 表达率与肝癌临床指标的关系

SSX mRNA 表达与肝癌患者的性别、年龄、HBV、AFP、病理分型、TNM分期、门静脉癌栓和肝硬化发生与否无显著相关性（P＞0.05）。见表1。

表1 SSX表达与临床指标的关系[n（%），n=28]

2.5 3 种SSX 基因共同表达情况

28例肝癌组织中，6例（21.4%）标本3 种SSX 基因均有表达，23例（82.1%）标本至少表达两种SSX 基因。

3 讨论

本研究课题所收集的肝细胞癌组织中SSX-1、SSX-3基因表达阳性率较高 （53.6%、57.1%），SSX-2 表达阳性率相对较低（35.7%）。这与以往研究所证实的SSX 基因家族在肝癌中有较高表达相一致[8-10]，其高表达的特性（表达率大于50%）提示该基因家族可能与肝癌的发生、发展密切相关。本研究28例肝癌组织中，6例（21.4%）标本3 种SSX基因均有表达，23例 （82.1%）标本至少表达两种SSX 基因；离体培养的肝癌细胞株7404、HePG2、7721 中SSX1～3基因的表达虽各不相同，但至少有一种基因表达，同时也存在基因的共表达。这3 种基因同时表达为采用多价疫苗进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。同时，本研究课题在癌旁组织和正常肝细胞株中没有检测到SSX 基因的表达，与Chen 等[11]发现在肝癌的少数癌旁组织中有微弱的SSX 基因表达不相符，原因可能与样本量较少有关，可扩大样本量后再深入研究验证。SSX 基因在肝癌中高频率表达，而在非癌中不表达，又为肝癌特异性免疫治疗提供了潜在靶位。

目前对于肝癌的诊断仍以AFP的检测和影像学检查为主，这两种方法都可能出现假阳性和假阴性，所以寻找一种特异性更高的诊断方法成为临床上的迫切所需。本研究结果与肝癌临床指标结合后发现：SSX1～3 基因表达与年龄、性别、病理分型、TNM分期、HBV、血清AFP 水平、门脉癌栓、肝硬化无显著相关性（P＞0.05）。而研究结果又显示：相当一部分AFP 正常（≤ 20 μg/L）肝癌患者存在SSX基因表达，提示可以将SSX1～3 基因mRNA 作为肿瘤标志物，用于肝癌的辅助诊断。

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