线粒体DNA3 1 6 0～3 7 55区域基因突变与2型糖尿病的关系

郑寿焕 杨秀丽 姚庆春 李 兰 车惠英 王敬衔

1.延边大学附属医院内分泌科，吉林延吉 133000；2.吉林油田总医院内分泌科，吉林松原 138000

糖尿病是一种遗传和环境多种因素综合作用的疾病，近年来研究提示，部分糖尿病的发生与线粒体基因突变有一定的关联[1-2]。WHO将线粒体基因突变型糖尿病归认为特殊类型的糖尿病。由于不同种族、不同地区的2 型糖尿病（T2DM）患者中线粒体基因的突变率不同，线粒体基因突变与糖尿病关系的报道不一。本研究对延边地区328例T2DM 患者（其中2例合并耳聋）及108例正常对照组线粒体DNA 3160～3755 区域基因进行突变分析，旨在探讨延边地区T2DM 患者中线粒体DNA 3160～3755 区域基因突变情况及了解该地区该区域线粒体基因突变与T2DM的关系，进而从中筛选出线粒体基因突变型糖尿病。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2009年12月～2012年2月在延边大学附属医院健康体检者108例，其中，男65例，女43例，平均年龄（30.4±9.7）岁，作为正常对照组，临床和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病，近3个月无服用任何药物史；选取同时期在延边大学附属医院内分泌科住院的T2DM 患者328例作为2 型糖尿病组，其中，男194例，女134例，平均年龄（35.1±6.9）岁。糖尿病诊断依据1999年WHO 诊断标准，排除妊娠、急性感染、肿瘤、外伤、心、肝疾病及服用羟甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物者。所有受检对象均为延边地区无血缘关系个体，均签署知情同意书。两组一般情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究均在医院伦理委员会通过情况下进行研究。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA 提取 采用Promega公司生产的Wizard@Genomic DNA Purification Kit 提取DNA。取被受检者肘静脉血2 mL 到加有EDTA 抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀，置于离心机中3 000 r/min离心10 min，取300 μL 白细胞加入到1.5mL离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA 去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。所得DNA经紫外分光光度计定量，并置于-70℃保存备用。

1.2.2 PCR 扩增mtDNA 3160～3755 区域基因片段 根据GenBank 中的序列参考文献报道[2]，采用长春百奥生物技术有限公司合成上游引物：5'-AGCGCCTTCCCCGGTAAATGA-3'， 下游引物：5'-AGAATGATGGCTAGGGTGACTTC-3'。 PCR 扩增体系 （50 μL）包括：5 ×Green GO Taq Buffer 10 μL，MgCl22 μL，dNTP 1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.25μL， 灭菌注射用水29.75μL，DNA 5μL；PCR 循环参数：95℃预变性 5min，94℃变性 45s，56℃退火 35s，72℃延伸 45s， 循环 35次，最后72℃延伸7 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 扩增产物。

1.2.3 PCR 产物的限制性酶切 20 μL 酶切体系包括：PCR产物 5μL，HaeⅢ内切酶 0.5μL， 灭菌注射用水 14.5μL，置于37℃水浴箱中水浴4 h。5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

1.2.4 PCR 扩增产物直接测序 PCR 产物用凝胶电泳DNA回收试剂盒纯化回收DNA 片段后，送北京奥莱博生物技术有限责任公司，完成PCR 扩增产物测序。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用 χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测情况

线粒体DNA 3160～3755 区域经PCR 扩增后得到产物片段长度为596 bp，见图1。限制性内切酶HaeⅢ酶切位点为GG↓CC， 无突变者在位点3316、3413、3428 和3608 处存在酶切识别点， 得到的片段长度为180、159、147、97 和15bp 5个片段， 如果位点 3243、3316、3394、3593、3714 发生突变，则产物片段的数量和长度均会改变。根据限制内切酶HaeⅢ酶切片段情况得到两种图谱，见图2～3，其中，图2 为线粒体基因3316 位点发生突变，图3 为线粒体基因3394 位点发生突变。

2.2 直接测序法检测情况

直接测序发现线粒体基因3316 位点发生G→A 变异，3394 位点发生T→C 变异。见图4～5（见封三）。

2.3 线粒体DNA 3160～3755 区域各位点突变情况

在328例T2DM 患者中共检出线粒体DNA 3316 G→A 突变12例，突变率为3.7%，在108例正常对照组中检出线粒体DNA 3316 G→A 突变4例，突变率为3.8%（P＞0.05）；在328例T2DM 患者中共检出线粒体DNA3394 T→C 突变24例，突变率为7.3%，在108例正常对照组中检出线粒体DNA 3394 T→C 突变2例，突变率为1.8%（P＜0.05）；在328例T2DM 患者中及108例正常对照组中均未检测到线粒体 DNA3243 A→G、3593T→C 和 3714 A→G突变。

3 讨论

线粒体基因突变糖尿病被WHO公认为一种特殊类型的糖尿病，目前根据发病特点和一般的常规检查很难确诊，临床上一般按照T2DM 进行诊疗。因此，本实验旨在了解延边地区线粒体基因3160～3755 区域基因突变情况，进而从中筛选出线粒体基因突变型糖尿病，采取针对性的个性化治疗。

线粒体是细胞内的动力工厂，它主要通过氧化磷酸化功能为生物组织和细胞提供能量和ATP 进行生命活动。线粒体DNA是具有自我复制、转录和翻译功能的环状双链DNA分子。线粒体DNA 3316 和3394 突变均位于呼吸链复合物NADH 脱氢酶第1 亚单位（ND1）基因的高度保守区，线粒体DNA3316 G→A 突变使丙氨酸被苏氨酸替换，3394 T→C 点突变使酪氨酸变成组氨酸，上述两位点突变均改变了NADH 脱氢酶（复合体）亚单位1的二级结构，从而影响呼吸链复合体Ⅰ酶活性，影响线粒体氧化磷酸化的能力，ATP 生成减少，降低胰岛细胞分泌胰岛素的能力，使胰岛素作用缺陷，从而诱发糖尿病[1]。关于不同地域不同种族中该位点突变与糖尿病关系的报道结论不一致。

国外学者研究认为，在糖尿病人群中3316 G→A 突变率为3.4%，而在正常人群中检出3316 突变率为1.0%，且两组检出率差异有统计学意义[3]。Nakagawa 等[4]认为线粒体DNA 3316 G→A 突变是T2DM的致病性基因突变。Deng等[5]研究结果显示，线粒体DNA 3316 G→A 突变不是糖尿病发病的主要易感基因，可能只引起T2DM的发病风险性增高，间接地说明线粒体DNA 3316 G→A 突变在糖尿病的发生发展过程中不起主要作用。也有研究报道该基因突变仅为人群中的基因多态性，与T2DM的发生无关[6-7]。本实验在328例T2DM 患者中共检出线粒体DNA 3316 G→A 突变12例，突变率为3.7%；在108例正常对照组中检出线粒体DNA 3316 G→A 突变4例，突变率为3.8%（P＞0.05），提示线粒体 DNA 3316 G→A 突变与延边地区T2DM的发生可能无关，考虑可能与线粒体基因的阈值效应特性有关。

日本研究证实，线粒体DNA 3394 T→C 在糖尿病中的突变率为4.9%，在正常人群中为1.3%，二者之间差异有统计学差异（P＜0.05），提示线粒体DNA 3394 T→C 与糖尿病的发生有一定的相关性[8]。国内报道在T2DM 人群中3394 T→C 突变率为3.0%～6.0%，正常人群为0～2.06%[9]。本课题在328例T2DM 患者中共检出线粒体DNA 3394 T→C 突变24例，其突变率为7.3%；在108例正常对照组中检出线粒体DNA 3394 T→C 突变2例，其突变率为1.9%（P＜0.05）。经统计分析后认为，线粒体DNA 3394 T→C 变异与延边地区T2DM 有一定的相关性。笔者认为线粒体DNA 3394 T→C 突变可能属于线粒体突变糖尿病。

早在1992年有学者报道了一个母系遗传的伴有耳聋的糖尿病家系，证实该家系中存在线粒体DNA tRNA leu（UUR）3243 A→G的突变[10]。而中国云南的225例糖尿病人群中未检出该位点的突变[7]。本研究在糖尿病合并耳聋的2例患者中未发现3243 位点的突变，在2 型糖尿病组及正常对照组均未检测到3593、3714 位点的突变，考虑可能上述位点的突变率极低，有待扩大样本量进一步的研究。

综上所述，笔者认为线粒体DNA 3316 G→A 突变与延边地区T2DM的发生无关；线粒体DNA 3394 T→C 突变与延边地区T2DM的发生有关；线粒体DNA 3423 A→G，3593 T→C，3714 A→G 突变在延边地区T2DM 中的突变率为0，提示上述位点基因突变率极低。

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