蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼生长、免疫与抗氧化指标及抗病力的影响

明建华 叶金云 张易祥 杨 霞 吴成龙 邵仙萍 刘 沛

(湖州师范学院生命科学学院1，湖州 313000)

(大连海洋大学水产与生命学院2，大连 116023)

随着水产养殖业向集约化、规模化方向发展，养殖环境中的各种胁迫因子不断增多，易导致养殖动物病害滋生，而抗生素和化学合成消毒剂的使用会造成耐药性和药物残留等诸多问题。因此，通过营养调控手段来提高鱼类的免疫力和抗应激能力日益受到重视。蝇蛆不仅蛋白质与氨基酸含量高，而且体内还含有抗菌肽、几丁糖、凝集素等具有免疫调节功能的物质［1－4］。王娓等［2］研究发现，蝇蛆可以显著提高中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的抗杆状病毒感染能力，激活对虾的酚氧化酶系统。陈乃松等［3］以少量蝇蛆粉替代鱼粉饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，在一定程度上提高了对虾抵抗弧菌的能力，但对虾生长和饲料效率无正面影响。张洪玉等［4］研究表明，蝇蛆可显著提高中国对虾的生长速度，并增强抗白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的感染力。L－肉碱(β－羟基－γ－三甲胺丁酸)是一种多功能的绿色饲料添加剂，主要参与机体的能量代谢，是脂肪酸进入线粒体进行β－氧化的载体，可以加速脂肪的氧化，具有节约蛋白质、促进生长等作用［5］。近些年来，人们发现L－肉碱还具有抗细胞凋亡、免疫调节及抗氧化等功能［6－7］。

青鱼(Mylopharyngodon piceus Richardson)是我国传统淡水养殖的“四大家鱼”之一，据《2011中国渔业统计年鉴》，我国养殖青鱼年产量为42.4万t。近年来青鱼养殖病害有逐年上升的趋势，而有关蝇蛆粉、L－肉碱作为青鱼免疫增强剂的相关研究在国内外尚未见报道。鉴于此，本试验在青鱼饲料中分别添加蝇蛆粉和L－肉碱，探讨其对青鱼鱼种生长、免疫和抗氧化指标以及抗病原菌感染能力的影响，以期为研制安全环保的饲料添加剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼种、添加剂及日粮

青鱼:湖州荻港徐缘生态旅游开发有限公司水产养殖部。试验选择270尾体质健壮，规格和体重基本一致的青鱼鱼种，初始体重(72.23 ±1.81)g，随机分成3组，即对照组、蝇蛆粉组和L－肉碱组，每组设3个重复，分别饲养于设置在15亩池塘的9只网箱(规格为 3.0 m ×2.0 m ×1.5 m，水深 1.0 m)中，每只网箱放养30尾。

蝇蛆粉购自浙江德清绿态农业科技有限公司，含干物质为93.27%、粗蛋白为53.46%，粗脂肪为22.4%;L－肉碱由北京桑普生物化学技术有限公司提供，有效质量分数为20%。

试验饲料组成及主要营养成分见表1，3种饲料等氮等能，以基础日粮饲喂对照组，其余2组分别投喂添加蝇蛆粉25 g/kg、L－肉碱150 mg/kg(有效含量)的试验饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，采取逐级扩大法添加微量成分，使各组分充分混匀后，用小型饲料造粒机制成粒径2 mm的沉性颗粒饲料，40℃烘干后于4℃冰柜中保存备用。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础，%)

1.2 饲养管理

青鱼鱼种在池塘网箱中驯养7 d后投喂试验饲料。每天投喂2次(8∶30、16∶30)，日投饲量为鱼体重2%～5%，并根据水温、气候变化及鱼类摄食情况作适当调整，以每次投饲后1 h无残饵为宜。饲养期间水温为26～29 ℃，pH 为6.8～7.6，溶解氧 ＞5 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L。正式养殖60 d后结束，测定鱼体长和体重。

1.3 攻毒试验

病原菌采用浙江省淡水水产研究所提供的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi1a)。按王文博等［8］所述方法，将两次活化后的嗜水气单胞菌用无菌生理盐水稀释，使终浓度为1×107cells/mL。饲养试验结束后，选择体重基本一致的青鱼进行攻毒试验，每只网箱取10尾鱼，按每100 g鱼重腹腔注射菌液0.5 mL;另外从对照组的每个网箱中再选取5尾青鱼注射相同剂量生理盐水作为攻毒对照。观察1周，统计各组鱼的死亡率和相对保护率。

1.4 采样与处理

饲养试验结束后，禁食24 h，将各网箱鱼称重计数，每箱随机选取4尾体重相近的青鱼，用浓度为200 mg/L的MS－222作快速深度麻醉，经称重和量体长后用一次性医用注射器从尾静脉采血。血样在4℃冰箱中静置1～2 h后，以4℃ 3 000 r/min离心10 min制备血清，－20℃冻存备用。鱼体采血后立即剖开腹腔，剥离出内脏和肝胰脏并称重，取适量肝脏用于常规分析，取部分背鳍下方侧线以上的背部肌肉用于肌肉成分分析，均以－20℃保存。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 相关指标的计算公式

分别按下式计算增重率、特定生长率、饲料系数、成活率、肝体比、内脏比、肥满度、死亡率和相对保护率。

增重率=(Wt－W0)/W0×100%

特定生长率=(lnWt－lnW0)/t×100%

饲料系数=FI/(W2+W3－W1)

成活率=Nt/N0×100%

肝体比=Wh/Wb×100%

内脏比=Wv/Wb×100%

肥满度=Wb/L3×100%

死亡率=Nd/Ni×100%

相对保护率=(Mc－Mt)/Mc×100%

式中:W0为鱼初体均重/g;Wt为鱼末体均重/g;t为饲喂天数/d;FI为每箱鱼摄食饲料总量/d;W1为每箱鱼初体总重/d;W2为每箱死鱼的总重/d;W3为每箱鱼末体总重/d;N0为初鱼尾数;Nt为末鱼尾数;Wh为每尾鱼末肝脏重/d;Wv为每尾鱼末内脏重/d;Wb为每尾鱼末体重/d;L为每尾鱼末体长/cm;Nd为攻毒后死亡鱼尾数;Ni为受感染鱼尾数;Mc为对照组鱼死亡率/%;Mt为试验组鱼死亡率/%。

1.5.2 饲料和肌肉样品成分分析

水分含量采用105℃烘箱干燥法(GB 6435—1986)测定;粗蛋白质含量采用微量凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)测定;粗灰分含量采用550℃灼烧法(GB/T 6438—1992)测定;磷含量采用钼黄分光光度法(GB/T 6437—2002)测定;总能利用氧弹测热仪测定。

1.5.3 血液生化指标的测定

总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、补体C3和C4、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)等在美国贝克曼Cx－4型全自动生化分析仪上测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 肝脏抗氧化指标的测定

肝脏样品解冻后，用冷生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干后称重，肝脏与匀浆介质(pH 7.4)按1∶9(W∶V)的比例冰浴匀浆，制成10%匀浆液，然后4℃4 000 r/min离心10 min，取上清液用于分析。青鱼肝脏SOD、GSH–Px、CAT和MDA的水平均用南京建成生物工程研究所的相应试剂盒测定。

1.6 数据统计与分析

试验数据用SPSS 13.0统计软件包中的单因素方差分析(one－way ANOVA)和 D uncan氏多重比较，P﹤0.05表示差异显著。试验结果以平均值±标准差(±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼生长性能的影响

从表2可见，与对照组相比，蝇蛆粉和L－肉碱组青鱼增重率和特定生长率均显著提高(P＜0.05)，其中增重率分别提高了17.31%、13.98%，而特定生长率分别提高了10.59%、8.82%。蝇蛆粉和L－肉碱组的饲料系数较对照组分别显著下降了11.29%、13.44%(P＜0.05)。饲料中添加蝇蛆粉和L－肉碱有提高青鱼成活率的趋势(P＞0.05)。在形体指标上，蝇蛆粉和L－肉碱组鱼体肝体比、内脏比和肥满度与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，但有下降趋势。由此可见，蝇蛆粉和L－肉碱均可促进青鱼的生长，降低饲料系数，但对鱼体形体指标无显著影响。

表2 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼生长及形体指标的影响

2.2 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼肌肉成分的影响

由表3可知，与对照组相比，蝇蛆粉和L－肉碱组青鱼肌肉粗蛋白含量有升高的趋势，而水分、粗脂肪和灰分的含量有下降趋势(P＞0.05)。可见，蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼肌肉成分无显著影响。

表3 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼肌肉成分的影响

2.3 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼血清免疫指标的影响

由表4可知，与对照组相比，蝇蛆粉和L－肉碱组鱼血清总蛋白、溶菌酶的水平均显著提高(P＜0.05)，其中总蛋白含量分别提高了21.50%、18.70%，溶菌酶活性则分别提高了21.45%、14.52%。蝇蛆粉组鱼血清碱性磷酸酶的活性也较对照组显著提高了13.21%(P＜0.05)，而L－肉碱组与对照组的差异不显著(P＞0.05)。蝇蛆粉和L－肉碱组鱼血清补体 C3、C4的活性均显著高于对照组，且蝇蛆粉组补体C4的活性还显著高于L－肉碱组的水平(P＜0.05)。蝇蛆粉和L－肉碱组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性均较对照组低，但差异均不显著(P＞0.05)。由此可见，蝇蛆粉和L－肉碱均可不同程度地提高青鱼血清总蛋白、溶菌酶、碱性磷酸酶以及补体C3、C4的水平，从而增强鱼体的非特异性免疫力。

表4 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼血清免疫指标的影响

2.4 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响

由表5可知，在血清中，蝇蛆粉组SOD和CAT的活性显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高了19.77%、36.10%，而L－肉碱组SOD 和CAT的活性与对照组的差异均不显著(P＞0.05);蝇蛆粉和L－肉碱组GSH－Px的活性分别比对照组显著提高了20.94%、28.63%，而MDA的含量则分别比对照组显著下降了 17.61%、22.09%(P ＜0.05)。在肝脏中，蝇蛆粉和L－肉碱组青鱼SOD、GSH－Px和CAT的活性均显著高于对照组，而MDA的含量则均显著低于对照组(P＜0.05)。由此可见，蝇蛆粉和L－肉碱均可提高青鱼血液和肝脏的抗氧化能力。

表5 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响

2.5 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼感染嗜水气单胞菌后的保护作用

由表6可知，青鱼人工注射感染嗜水气单胞菌1周后，对照组鱼的死亡率为90.00%，而蝇蛆粉和L－肉碱组青鱼的死亡率分别为63.33%、66.67%，相对保护率分别为29.63%、25.92%。对照组中注射生理盐水的青鱼没有发生死亡现象，可排除试验操作导致的青鱼死亡。可见，蝇蛆粉和L－肉碱可增强鱼体的抗病原感染力，对青鱼有一定的免疫保护作用。

表6 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼感染嗜水气单胞菌后的保护作用

3 讨论

3.1 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼生长性能的影响

蝇蛆粉在已有的研究报道中主要作为蛋白源的替代。马建品等［9］用含25%蝇蛆粉的颗粒饲料饲喂草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，与含20%秘鲁鱼粉饲料的对照组相比，蝇蛆粉组鱼体增重率提高了20.8%，蛋白质效率提高了 16.4%。张洪玉等［4］研究表明，与配合饲料相比干蝇蛆可显著提高中国对虾的生长速度。本试验投喂的3种等氮等能饲料中，添加25 g/kg蝇蛆粉饲料组可显著提高青鱼的增重率和特定生长率、降低饲料系数，这可能与蝇蛆中含有未知的促生长因子有关。Ajani等［10］和 Ogunji等［11］将蝇蛆粉部分或全部替代罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲料中的鱼粉，对鱼体的增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率均无显著影响;陈乃松等［3］和曹俊明等［12］在凡纳滨对虾(L.vannamei)的相应研究中也得出了类似的结论。

对很多鱼类而言，L－肉碱是一种促生长剂，参与机体的能量代谢，是脂肪酸进入线粒体进行β－氧化的载体，可促进脂肪的氧化供能，加快新陈代谢速度，提高饲料转化率，节约蛋白质的消耗［13－14］;另外，添加外源的L－肉碱弥补了鱼体合成肉碱的不足，减少了鱼体内或饲料中赖氨酸和蛋氨酸的消耗，这被认为是L－肉碱促进生长的主要原因。研究表明，在饲料中添加适量L－肉碱可促进草鱼［14］、奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus× Oreochromis aureus)［15］和斑点鲈(Morone saxatilis♂ × M.chrysops♀)［16］的生长，提高了饲料效率。本试验中，青鱼摄食添加150 mg/kg L－肉碱的饲料后得到与上述报道一致的结果。但也有一些研究认为饲料中添加肉碱对鱼类生长和饲料系数并无影响，如大西洋鲑(Salmo salar)［17］、非洲鲶(Clarias gariepinus)［18］和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)［19］等。这些结果表明，蝇蛆粉和L－肉碱对鱼类生长的作用效果可能受多种因素影响，如品种、生长发育阶段、饲料组成与营养水平等，表现出一定的差异性。

3.2 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼免疫力和抗病力的影响

鱼类血液成分的变化被广泛地用来评价鱼体的健康状况、营养状况以及对环境的适应状况，是重要的生理、病理和毒理学指标［20］。溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子之一，它产生于嗜中性粒细胞和巨噬细胞，并被分泌到血液及黏液中发挥溶菌效应，研究表明机体溶菌酶活性提高，其免疫力也相应提高［21－22］。碱性磷酸酶(AKP)是一种重要的代谢调控酶，可通过改变病原体的表面结构而增强被侵袭机体对病原体的识别和吞噬能力［23］，有助于提高鱼体的抗病力。补体是抵抗病原微生物感染的重要成分，在硬骨鱼类中补体具有细胞溶解、细胞黏附、中和毒素、清除病原菌等重要的生物学效应［24－25］。补体C4参与补体经典途径的激活过程，而补体C3在补体激活的经典途径和替代途径中都起作用［25］。本试验中，蝇蛆粉可显著提高青鱼血清溶菌酶、AKP、补体 C3和 C4的活性(P ＜0.05)，从而增强鱼体的非特异性免疫力。这与张洪玉等［4］和刘丽波等［26］有关蝇蛆可提高对虾免疫力的报道相一致，可能与蝇蛆中含有抗菌肽、凝集素和溶菌酶等免疫活性物质有关［1－4］。曹俊明等［12］研究认为饲料中含适量蝇蛆粉可提高对虾血清酚氧化酶活性，但对AKP的活性无影响，而陈乃松等［3］在饲料中以少量蝇蛆粉替代鱼粉导致对虾血清溶菌酶的活性下降。目前有关L－肉碱对鱼类非特异性免疫力的影响还鲜见报道，本试验中L－肉碱可显著提高青鱼血清溶菌酶、补体 C3和 C4的活性(P ＜0.05)，但对 AKP活性无显著影响。这可能与L－肉碱具有免疫调节及免疫治疗的作用有关［5－7］。

嗜水气单胞菌的攻毒试验也表明，蝇蛆粉和L－肉碱组青鱼的死亡率均明显低于对照组。由于大多数鱼类特异性抗体的产生需要长期的适应并通过产生记忆而形成［27］，因此本试验中青鱼相对保护率的提高，可能与蝇蛆粉、L－肉碱提高了鱼体溶菌酶、碱性磷酸酶、补体C3和C4以及SOD等非特异性免疫酶的活性有关［21－24，27］，从而增强了鱼体的抗病力。

3.3 蝇蛆粉和L－肉碱对青鱼抗氧化能力的影响

动物机体在新陈代谢的过程中，活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的产生和消除保持着动态平衡，过多的自由基会引起脂质过氧化反应，丙二醛(MDA)是脂质过氧化物的主要成分，具有很强的生物毒性，会破坏细胞的结构和功能［28］。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)和过氧化氢酶(CAT)等组成的抗氧化酶系统可清除过多的自由基，减少脂质的过氧化损伤［11，28－29］，其中SOD可特异性地催化超氧化物自由基歧化为过氧化氢和氧，过氧化氢在CAT和GSH－Px的作用下生成无毒性的水和氧;GSH－Px还可介导还原型谷胱甘肽催化脂质过氧化物分解成相应无毒性的醇。因此，检测鱼体血液和肝脏中SOD、GSH－Px、CAT和MDA的变化可较准确地反映机体内的抗氧化状况。

本试验中，蝇蛆粉可显著提高青鱼血清和肝脏中SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA的含量(P＜0.05)，这表明饲料中添加适量蝇蛆粉可增强鱼体的抗氧化能力，保护机体免遭过氧化物的损伤。但也有研究认为蝇蛆粉对对虾血清SOD［3，12］和罗非鱼肝脏CAT［11］的活性无明显影响。L－肉碱抗氧化功能主要表现在抑制ROS的产生、防止大分子氧化损伤和提高抗氧化酶类的活性及基因表达等［30－31］。目前，有关L－肉碱对鱼类抗氧化能力的研究鲜见报道。本试验中L－肉碱可不同程度地提高青鱼血清与肝脏中SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA的含量，从而增强鱼体的抗氧化能力。

4 结论

在饲料中添加蝇蛆粉25 g/kg或L－肉碱150 mg/kg可促进青鱼的生长，提高鱼体的非特异性免疫力和抗氧化能力，增强鱼体抗病原菌的感染力，对防病抗病有一定的功效。

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