响应面法优化鸭胸肉盐溶蛋白的提取工艺

王 伟，汪梦非，姚 遥，姜发堂，肖 满，倪学文

（湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院，湖北武汉430068）

肌肉盐溶蛋白占肌肉的70%～90%，是影响肉蛋白凝胶功能特性的主要肌肉蛋白，直接影响肉制品的组织特性、保水性、黏结性和产品得率[1]，因此盐溶性蛋白的性能决定肉制品的最终品质[2]。盐溶蛋白是肉糜形成弹性凝胶的主要成分之一，在制备肉糜﹑重组肉等其他产品过程中，盐溶蛋白的浸出率对后序加工、制品的品质有着举足轻重的作用。盐溶蛋白的高浸出率，有利于改良肉糜的质构，提高肉的加工性能。目前肉制品如在火腿的的滚揉工序中，其主要目的就是使盐溶蛋白尽可能多的浸出。但对于鸭肉加工来说，滚揉对盐溶蛋白的浸出影响不大，因此就要对其他条件进行研究[3]。白艳红等[4]利用响应面优化法研究pH、NaCl、MgCl2和复合磷酸盐（MP）对猪后腿肉盐溶蛋白提取率的影响；丁宁等[5]采用响应面分析法对鲨鱼盐溶蛋白的提取条件NaCl浓度、pH和低温加热时间进行了优化；王莉莉[6]对鹅肉盐溶蛋白质的提取条件进行了研究，确定了NaCl浓度、提取液pH、浸提时间3个因素的取值范围；Boyer等[7]研究了离子强度对兔肉的盐溶蛋白的影响；Shikha等[8]在研究了pH对盐溶肉蛋白的影响后发现提高pH使盐溶蛋白偏离其等电点，且而关于鸭肉盐溶蛋白提取的研究报道较少。本文通过对鸭肉盐溶蛋白提取过程中影响因素的分析，在单因子实验的基础上，应用响应面法（RSM）对鸭肉盐溶蛋白的提取条件进行优化，提高鸭肉盐溶蛋白的提取率，得到最佳的盐溶蛋白提取工艺，为鸭肉的进一步综合开发和合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭胸肉选自湖北本地的荆江麻鸭 武汉南湖中商超市冷冻鸭胸肉，屠宰期不超过一周；考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白 湖北晶茂生物科技有限公司；NaCl 分析纯，山东莱阳市双双化工有限公司。

GL-52型高速冷冻离心机 湖南长沙平凡仪器仪表有限公司；BP221S型电子分析天平 德国Sartorius公司）；DS-1型组织捣碎机 浙江金坛市华龙实验仪器厂；FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV 1900型紫外可见分光光度计 上海荆和分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理 鸭胸肉剔除筋键、脂肪后，切成小块装于保鲜袋，-18℃以下冻藏，使用前于4℃下解冻。

1.2.2 鸭肉盐溶蛋白的提取 根据DeFreitas[9]和Bertram[10]的方法，并略作改进如下：鸭肉与一定浓度的盐溶液按比例倒入组织捣碎机搅成肉浆状，4℃静止一段时间后，以12000×g在4℃下离心30min，上清液用3层滤布过滤，去离子水稀释至盐浓度小于0.1mol/L，离心收集上清液，然后用去离子水稀释上清液，重复上述过程，得到的上清液即盐溶蛋白溶液。

1.2.3 鸭肉盐溶蛋白的测定 参考王孝平等[11]考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 浸提时间对盐溶蛋白提取量的影响 在盐浓度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提溶液pH7.5条件下，实验分五个水平，提取时间分别为1、5、10、15、20h。提取盐溶蛋白后，每组分别取1.0mL，测其蛋白浓度。

1.2.4.2 NaCl浓度对盐溶蛋白提取量的影响 在pH=7.0，固液比1∶4，提取时间10h的条件下，研究0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L的氯化钠溶液对提取盐溶蛋白的影响。提取盐溶蛋白后，每组分别取1.0mL，测其蛋白浓度。

1.2.4.3 固液比对盐溶蛋白提取量的影响 在盐浓度0.5mol/L、浸提时间10h、浸提溶液pH为7.5条件下，实验分五个梯度，固液比（g/V）分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。提取盐溶蛋白后，每组分别取1.0mL，测其蛋白含量，然后根据固液比例乘以稀释倍数得到每组的蛋白总量。

1.2.4.4 浸取溶液的pH对盐溶蛋白提取量的影响 肌肉蛋白质的等电点在pH5.5～6.0时肌肉蛋白的提取对pH较为敏感。根据文献资料，肉类盐溶蛋白提取pH通常在6.0～8.5之间，因此选取pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，固定盐浓度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提时间10h。

1.2.5 响应面（RSM）实验设计 根据Box-Behnken中心设计原理，以NaCl浓度、浸提溶液pH、固液比、浸提时间四个因素为自变量，并以-1、0、1分别代表自变量的低、中、高水平，以鸭肉盐溶蛋白提取率为响应值，设计4因素3水平实验，设计27个实验点，其中24个析因点，3个零点，实验因素见表1。

表1 响应面实验因素水平Table 1 The levels and factors of response surface experimental

1.2.6 数据统计 每次实验设3个平行，取平均值。数据采用SAS 9.2软件进行统计分析[12-14]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验及分析

2.1.1 浸提时间对盐溶蛋白提取量的影响 由图1分析可知，在NaCl浓度、浸提溶液pH、固液比不变的情况下，0～5h蛋白含量曲线的斜率最大，说明此时溶液中蛋白浸出速度快。这是因为溶液中蛋白含量低，肉中的蛋白含量高，渗透压大，蛋白迅速向溶液中扩散；5～10h，随时间的延长，溶液中蛋白含量增加的速度有所减缓（p＜0.05），这是因为经过一段时间的扩散，肉和溶液中的蛋白浓度差缩小，渗透压减小所致[15]；10h后，溶液中的蛋白浓度接近肉中的蛋白浓度，盐溶蛋白已基本溶出。如果时间过长，蛋白质的性质会发生变化，细菌也会大量滋生，不利于后期实验，综合考虑，10h是比较合理的浸提时间。

2.1.2 NaCl浓度对盐溶蛋白提取量的影响 由图2可以看出，盐浓度在0.1～0.5mol/L时，蛋白含量随着盐浓度的提高而增加；在0.5～0.9mol/L，蛋白浓度随着盐浓度的升高而降低。这是因为盐浓度能够改变氨基酸侧链的电荷分布，改变盐溶蛋白在溶液中的存在状态，使蛋白质和蛋白质的相互作用降低或增加，进而影响其溶解性。因此，盐浓度0.5mol/L是较优的选择。

2.1.3 固液比对盐溶蛋白提取量的影响 在图3中，在固液比为1∶2时，由于提取液太粘稠，在高速离心下无法分层，从而无法测定。固液比1∶3～1∶5时，蛋白质的总含量随着固液比值的减小而显著增加（p＜0.05），但到1∶6时，蛋白总量增加较少。考虑到固液比值太小，对下一步骤离心过程的影响，所以固液比选择1∶5。

2.1.4 浸取溶液的pH对盐溶蛋白提取量的影响 保持NaCl浓度等其他因素不变，在浸提溶pH6.0～7.5，蛋白质提取率呈上升趋势，而在pH7.5～8.5，蛋白质提取率逐渐下降。原因是蛋白质分子既含有酸性基团，又含有碱性基团，高pH使盐溶蛋白质偏离其等电点，蛋白质分子带有同种电荷，互相排斥，蛋白质与蛋白质的相互作用减弱，而蛋白质和水之间的相互作用则加强，导致蛋白质的溶解度变大，溶液中的蛋白含量增加，但过高的pH会引起蛋白质变性，而且在碱性条件下也不利于防腐，综合考虑，浸提溶液的pH选择7.5。

2.2 响应面设计及结果

通过对实验结果进行响应面分析，所选用的二次多项模型具有高度的显著性（p＜0.0001）。经过二次回归拟合后，得出拟合方程式为：

Y=18.7+0.875X1+1.316667X2+1.016667X3+3.841667X4-0.791667X12-0.175X1X2-0.275X1X3-0.075X1X4-2.654167X22+1.1X2X3-0.625X2X4-2.029167X32-0.375X3X4-2.766667X42。其中复相相关系数R2=96.21%，修正决定系数为91.79%，说明该模型能解释91.79%响应值的变化，仅有总变异6.51%不能用此模型来解释，所以该模型拟合程度良好，用该模型对鸭肉盐溶蛋白提取工艺进行优化是合适的。

表2 实验设计及响应值结果Table 2 Experimental design and response value

表3 方差分析Table 3 The analysis of anova

图5 浸提溶液pH、浸提时间、溶液NaCl浓度、固液比交互影响提取率的曲面图Fig.5 The surface chart of extraction solution pH，extraction solution concentration of NaCl，material to water ratio，extraction-duration

方差分析表明（表3），X2、X4、X22、X32、X42对蛋白提取率的影响极显著（p＜0.001），表明在提取鸭肉盐溶蛋白的过程中，NaCl浓度、浸提溶液pH、固液浓度的平方项、固液比的平方项、浸提溶液pH的平方项对盐溶蛋白提取的影响极显著（p＜0.01）。X1、X3、X2X3影响显著（p＜0.05），即在提取过程中，浸提时间、固液比、NaCl浓度和固液比的交互作用对提取率的影响显著（p＜0.05）。

根据回归方程，作出响应面立体图，见图5。从图5（a）～5（c）可以看出，保持其他因素不变，蛋白质提取率随着浸提时间先上升，然后达到稳定。保持浸提时间不变时，随着NaCl浓度的增加，蛋白质提取率先增高后降低。随着固液比的比例增大，蛋白质提取率上升后趋于平稳。其中，由图5（c）可以看出，保持浸提时间不变，蛋白质提取率随着pH的上升而先上升后下降，这是因为提高pH使盐溶蛋白偏离其等电点，使蛋白质的净电负荷增加，造成蛋白质和蛋白质的相互作用减弱，和水的相互作用增加，蛋白质的溶解度增大，盐溶蛋白提取充分；但过高的pH会使蛋白质变性。本研究结果与Shikha等[8]的研究一致。图5（d）显示在固液比不变的情况下，随着NaCl浓度的增加，蛋白质提取率先增高后降。图5（e）可知，保持pH不变，随着NaCl浓度的上升，盐溶蛋白提取率先上升后下降，因为NaCl浓度能够改变氨基酸侧链的电荷分布，进而影响其溶解性，对蛋白提取率产生显著的影响（p＜0.001）。由图5（f）可知，相比固液比，浸提溶液pH对蛋白质提取率有着明显的影响，保持固液比不变，蛋白质提取率随着pH的上升而先上升后缓慢下降。

以上4个因素对盐溶蛋白提取率的影响从大到小依次为：浸提溶液pH（X4）＞溶液NaCl浓度（X2）＞固液比（X3）＞浸提时间（X1），即浸提溶液pH和NaCl浓度对提取率的影响最为显著。最佳提取工艺条件：浸提溶液pH7.65、NaCl浓度0.52mol/L、固液比1∶5.21、浸提时间12.31h，鸭肉盐溶蛋白提取率的响应值为20.4%。

2.3 最佳条件的验证实验

考虑到实际的可操作性，将以上最佳条件修正为浸提溶液pH7.7、NaCl浓度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提时间12.3h，在此条件下进行三次实验，得到鸭肉盐溶蛋白提取率的平均值为19.9%，与理论值接近，说明采用RSM法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

本实验在单因素实验的基础上通过响应面法优化鸭肉盐溶蛋白提取实验，以鸭肉盐溶蛋白提取率作为响应值，设计了四因素三水平的响应面实验。实验结果表明浸提溶液pH、NaCl浓度、NaCl浓度的平方项、固液比的平方项、浸提溶液pH的平方项对蛋白提取率的影响极显著（p＜0.001），并得到鸭胸肉盐溶蛋白的最佳提取工艺条件：浸提溶液pH7.7、NaCl浓度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提时间12.3h，鸭肉盐溶蛋白提取率的响应值为20.4%，鸭肉盐溶蛋白的实际提取率为19.9%，相对误差为2.5%。本文为鸭肉盐溶蛋白的提取提供了一定的指导。

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