羧基磁珠吸附乙型肝炎病毒表面抗原的性能研究＊

林梅双，吴晓蔓（广州医科大学附属第二医院，广州 510260）

磁珠被广泛应用于蛋白质的分离提纯、细胞分离、酶的固定、免疫分析等多个领域［1－4］。以磁珠为固相介质对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白质分离技术，与传统分离方法比较，蛋白质的磁分离技术具有快速、高纯、高收率等优点［5］。羧基磁珠是表面带有羧基功能团的磁珠，其吸附蛋白是基于磁珠表面的阴离子交换基团－COOH与表面带正电的蛋白之间的作用［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）分子量大，其结构变化对活性影响较大，结构和活性表征相对容易研究且手段多［7］，所以本文选择HBsAg作模型蛋白质。研究使用市场上广泛生产的表面带有羧基的聚合物磁珠吸附HBsAg的性能，为磁珠在蛋白质分离纯化中的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 血源性HBsAg纯品由上海叶民生物技术有限公司提供。

1.2 仪器与试剂 羧基磁珠与磁分离架分别由上海奥润微纳新材料科技有限公司和无锡中德伯尔生物技术有限公司提供，HBsAg酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和BCA蛋白质定量试剂由沈阳惠明生物工程有限公司和天根生化科技有限公司提供，瑞士TECAN酶标仪Infinite M200，以上试剂均在有效期内使用，严格按说明书操作。

1.3 方法

1.3.1 影响磁珠吸附HBsAg的因素 取1mL血源性HB－sAg纯品，加入200μL 5mg／mL的磁珠和18μL 1mmol／L氯化锌，混匀后，在37℃温箱中放置5min，通过磁场分离磁珠，吸出液体为吸附后溶液。改变磁珠用量、HBsAg原始浓度、吸附温度、吸附时间。BCA法测定吸附前、吸附后HBsAg的蛋白含量，计算吸附量。判断影响磁珠吸附HBsAg的因素。

1.3.2 HBsAg的洗脱 取某一浓度的血源性HBsAg纯品，按上述方法进行磁珠吸附后，用10mmol／L磷酸盐缓冲液（PBS），pH 5.0 3次清洗磁珠，加入250μL 10mmol／L 的NaOH溶液，洗脱1min后，通过磁场分离磁珠，吸出液体为洗脱液。BCA法测定吸附前、吸附后和洗脱液的HBsAg蛋白含量，计算洗脱率。将洗脱液稀释10万倍后，ELISA测定洗脱液的稀释液和不同浓度（2、5、10、15、20、25、30ng／mL）HBsAg标准品溶液HBsAg的吸光度（A）。通过标准品浓度－A值标准曲线，计算洗脱液HBsAg的生物活性浓度占BCA法检测的洗脱液HBsAg浓度的百分比，即为洗脱液中HBsAg的生物活性保留率。

1.3.3 判断吸附量与洗脱率 按以下公式计算：

Q＝（C0V0－C1V1）／m

洗脱率（%）＝C2V2／（C0V0－C1V1）×100%

式中：Q 为吸附量（μg／mg）；m 为磁珠的质量（mg）；C0、C1、C2分别为吸附前、吸附后和洗脱液的 HBsAg浓度（μg／mL）；V0、V1、V2分别为吸附前、吸附后和洗脱液的体积（mL）。

2 结 果

2.1 磁珠用量 随着磁珠用量的增加，吸附的总蛋白逐渐增多，但单位磁珠的吸附量却减少。见图1、2。

图1 磁珠用量对吸附HBsAg总量的影响

图2 磁珠用量对HBsAg吸附率的影响

2.2 HBsAg浓度 磁珠吸附HBsAg的量随HBsAg初始浓度的增加而增多，在较低浓度范围（小于200μg／mL）时，吸附量随HBsAg浓度的增加而增多趋势比较明显；而在较高的浓度范围（大于200μg／mL），趋势变缓。见图3。

图3 HBsAg浓度对HBsAg吸附率的影响

图4 温度对吸附HBsAg的影响

2.3 温度 随着温度增高，磁珠吸附HBsAg的能力也增强。见图4。

2.4 吸附时间 磁珠吸附在5min时达到峰值，但随着时间延长能力有所降低，大约在30min时进入平台期。见图5。

2.5 HBsAg的洗脱 磁珠吸附浓度为524.24μg／mL的血源性HBsAg纯品后，使用10mmol／L NaOH溶液洗脱HBsAg，洗脱率是71.02%，活性保留率为88.15%。

图5 吸附时间对吸附HBsAg的影响

3 讨 论

相对传统分离方法，蛋白质的磁分离技术有更多的优势。而表面带有－COOH功能基团在蛋白质分离提纯中比较常用。

本研究通过磁珠用量、HBsAg浓度、温度、吸附时间各方面来探讨市场上广泛生产的带有羧基的聚合物磁珠吸附HB－sAg的性能。结果显示：（1）随着磁珠用量的增加，吸附 HB－sAg的总蛋白量逐渐增多，但单位磁珠的吸附量却减少。磁珠用量的增加使有限空间内磁珠的总表面积增大，从而促进了吸附反应进行，但同时也大大降低了单个磁珠与HBsAg碰撞的机会，导致单个磁珠吸附 HBsAg的量降低。（2）磁珠吸附HBsAg的量随HBsAg初始浓度的增加而增多，在较低浓度范围时，吸附量随HBsAg浓度的增加而增多趋势比较明显；而在较高的浓度范围，吸附量随HBsAg初始浓度的增加而增多的趋势变缓。随着HBsAg浓度的增加，磁珠表面所吸附的HBsAg分子也逐渐增加，直至达到饱和状态，此时虽然再增加HBsAg的初始浓度，但受磁珠表面积的限制，HBsAg的吸附量也不会发生太大的变化。（3）随着温度增高，磁珠吸附HB－sAg的能力也增强。可能是温度会影响HBsAg分子的布朗运动，导致HBsAg与磁珠碰撞吸附行为的变化，低温（4℃）时，HBsAg吸附率略低，随温度升高，HBsAg吸附率逐渐增大。也可能是在pH接近中性的溶液中，磁珠吸附HBsAg的主要驱动力是疏水作用，通常情况下，在一定温度范围内疏水作用力会随温度升高而增强，导致磁珠吸附HBsAg增强。（4）磁珠吸附在5min时达到峰值，但随着时间延长能力有所降低，大约在30min时进入平台期。可见磁珠在较短时间内吸附HBsAg达到饱和，但是随着时间延长又慢慢解离，直到进入平衡状态。以上实验结果表明羧基磁珠能够吸附HBsAg，但不稳定，易受磁珠用量、HBsAg浓度、温度、吸附时间等多因素影响，在实验过程中要严格控制实验条件。

使用10mmol／L NaOH溶液洗脱 HBsAg的洗脱率是71.02%，活性保留率为88.15%。在一定pH条件下，羧基磁珠带负电会与带正电的基团在二价离子的作用下，发生共价结合，改变pH值会使结合上去的物质释放下来，因此被吸附在磁珠上的HBsAg可以通过NaOH溶液洗脱下来。实验证实磁珠吸附上的HBsAg不但可以洗脱下来，而且洗脱下来的HBsAg仍具有较好的抗原活性。在实验中发现，如果没有加入二价离子磁珠是无法吸附蛋白质的。至于为何要加入二价离子，有学者认为磁珠与二价金属溶液充分接触后，形成表面螯合二价离子的磁性金属亲和载体，可选择性吸附含组氨酸残基的蛋白质［8］。本次研究运用市场上广泛生产的带有羧基的磁珠吸附血源性纯HBsAg，探讨磁珠吸附HB－sAg的性能，确定磁珠吸附蛋白质的机制，为磁珠吸附其他蛋白质奠定基础。

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