血府逐瘀胶囊预处理对大鼠脑缺血再灌注后病理学改变及神经细胞凋亡的影响

杨仲红，任峻青，陈 勇

（河北北方学院附属第一医院药剂科，河北 张家口 075000）

血府逐瘀胶囊源自清代 《医林改错》，组方含有炒桃仁、枳壳、当归、川芎、红花、牛膝、柴胡、地黄、赤芍、甘草、桔梗等，有活血化瘀、行气通络之功效。现代医学研究表明，血府逐瘀胶囊中单药具有降低血液黏度、扩张血管、改善脑血流、改善微循环、抑制炎性反应等作用［1］。临床上常用来治疗缺血性脑血管病，疗效可靠，副作用小，但是，其作用机制尚未完全明了。本研究通过观察血府逐瘀胶囊预处理对SD大鼠脑缺血再灌注后组织病理学改变及神经细胞凋亡的影响，探讨其对脑缺血再灌注保护作用的可能的作用机制，以期进一步指导临床用药。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

健康SPF／UAF级SD （sprague-dawley）大鼠138只 ［许可证号：SCXK （京）2006-0008］，雄性，体质量250～290g，购自北京大学医学部实验动物科学部。饲养于20～22℃室温环境中，自由饮食进水。实验时，称重后随机将大鼠分成6组：正常组、假手术组、模型组、复方丹参片组、血府逐瘀胶囊A组、血府逐瘀胶囊B组，每组23只。各实验组均大脑中动脉栓塞缺血2h后，分别再灌注12h、24h、72h，假手术组除外。

1.2 药物与试剂

血府逐瘀胶囊：北京同仁堂有限公司生产（国药准字Z12020223，批号H200903020，规格0.4g×24粒）。复方丹参片：广州白云山制药厂生产（国药准字Z44023372，产品批号：C7A013，规格0.25g×60片）。凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。栓线［线长40mm，头端直径（0.32±0.02）mm，线身直径0.24mm］购自北京沙东生物技术有限公司，产品编号2432-100。

根据人与大鼠体表面积等效剂量折算表计算后，按相应剂量分别给予各组大鼠血府逐瘀胶囊、复方丹参片，采用口服给药，连续21d，每日1次。给药剂量分别为：血府逐瘀胶囊A组504mg·kg－1·d－1，B组1 008mg·kg－1·d－1，复方丹参片组236.25mg·kg－1·d－1。假手术组和模型组动物给予等量自来水口服。给药d 21，给药1h后行大脑中动脉栓塞，脑缺血再灌注手术。待各组大鼠术后清醒，进行Longa评分并观察活动度变化。

1.3 脑缺血再灌注损伤模型的制备

大鼠左侧大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型的制备参考Longa E Z等人文献采用改进Longa线栓法制备［2］。SD大鼠术前禁食24h，自由饮水，7%水合氯醛腹腔注射麻醉，350mg·kg－1。缺血时间2h。待动物清醒后，进行神经功能评分 （采用Longa评分标准，0分：无神经功能缺损体征；1分：不能充分伸展对侧前爪；2分：行走时向外侧转圈；3分：行走时向对侧倾斜；4分：不能行走，意识丧失），1～3分者纳入实验，不符合模型判断标准的动物剔除。假手术组只进行颈部切口，暴露颈外动脉，不插线，其余步骤与其他实验组保持一致。

1.4 动物灌注固定与取材

待各组大鼠缺血再灌注至所需时间点时，麻醉状态下，仰卧位固定大鼠，暴露心脏，从心脏常规灌注150mL 4%多聚甲醛固定，30min后迅速断头取脑，将脑组织从前向后等分成五等份，每份厚度约2～3mm，依次标记为A、B、C、D、E脑片，选取C脑片，4%多聚甲醛固定24h后备用。

1.5 TTC染色及脑梗死面积测定

缺血再灌注后，各组随机抽取5只大鼠，迅速断头取脑，切除嗅脑、小脑和低位脑干，将脑组织从前向后等分成厚度约2～3mm厚的五等份，选取中间脑片迅速置于2%TTC溶液中避光染色30min。4%多聚甲醛固定24h。染色结果，正常脑组织呈红色，缺血区呈灰白色，界线清晰。经计算机图像分析测量，计算脑梗死面积 （健侧脑片面积减去缺血侧TTC染色正常区面积）。

1.6 HE染色和TUNEL凋亡测定

制备常规石蜡切片，4℃储存备用。行HE染色观察病理形态，TUNEL法检测凋亡细胞。操作严格按说明书进行，经DAB显色后常规脱水、透明、封片，镜下观察分析。

1.7 统计学方法

实验结果采用SPSS 16.0软件包进行统计学处理。所有数据以均数±标准差 （±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能行为学评分及脑梗死体积

实验结果显示，缺血再灌注后，脑梗死体积百分比随再灌注时间的延长逐渐增大，至缺血再灌注24h时，复方丹参片组为 （39.23±0.38）%，血府逐瘀胶囊A组为 （37.12±0.37）%，血府逐瘀胶囊B组则为 （36.12±0.37）%。血府逐瘀胶囊 A、B组与模型组梗死面积 （41.01±0.38）%相比，明显减小（P＜0.05）。

表1 血府逐瘀胶囊预处理对缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响 （±s）

表1 血府逐瘀胶囊预处理对缺血再灌注大鼠神经功能行为学评分的影响 （±s）

注：n为SD大鼠只数。与正常组比较，△P＞0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05；与复方丹参片组比较，＃P＜0.05。

组别再灌注后神经功能行为学评分2h（n＝23） 24h（n＝23） 48h（n＝18）正常组 0±0 0±0 0±0＃假手术组 0±0△ 0±0△ 0±0△模型组 2.2±0.8△△ 2.8±0.4△△ 2.9±0.3△△复方丹参片组 2.0±0.6 2.5±0.5 2.4±0.5血府逐瘀胶囊A组 1.3±0.5＊ 1.7±0.5＊＃ 1.2±0.4＊＃血府逐瘀胶囊B组 1.2±0.4＊＃ 1.5±0.8＊＃ 1.2±0.4＊

2.2 病理组织学改变

光镜 （×400）下观察，模型组大鼠脑组织缺血侧皮质神经细胞数量、排列状态、组织间隙水肿程度均随缺血时间的延长呈进行性变化。病灶中心区甚至出现大量液化性坏死、囊性变、网状变。缺血半暗带明显，缺血中心区神经细胞体积明显缩小，胶质细胞固缩。

血府逐瘀胶囊预处理组及复方丹参片组与模型组相比，神经元、胶质细胞和血管的缺血性病理形态学改变程度较轻，胞体完整，突起较清楚，基本保持完整；组织间隙水肿较轻，炎性反应较轻。表明血府逐瘀胶囊预处理可不同程度的减缓脑缺血再灌注损伤时的脑组织病理改变。

2.3 凋亡细胞的观察

光镜下 （×400）观察，胞核中可见棕黄色颗粒者为阳性细胞即凋亡细胞，阴性细胞胞核呈蓝色。每张切片随机在梗死灶中心和周边区各选择10个不同视野，计数凋亡细胞数。结果显示，缺血对侧半球脑组织切片阳性细胞罕见，模型组缺血半球可见大量凋亡细胞，分布广泛，在缺血中心区和病灶周边区均可见。血府逐瘀胶囊预处理各组缺血侧脑组织凋亡细胞亦分布于整个缺血中心区，病灶边缘也可见少量凋亡细胞。血府逐瘀胶囊药物治疗组缺血侧脑组织阳性细胞数明显多于模型组阳性细胞数，差异具有统计学意义 （P＜0.05），各组凋亡细胞数目结果见表2、表3。

表2 血府逐瘀胶囊预处理对脑缺血再灌注大鼠梗死灶周边凋亡细胞值的影响 （±s）

表2 血府逐瘀胶囊预处理对脑缺血再灌注大鼠梗死灶周边凋亡细胞值的影响 （±s）

注：与正常组比较，△P＞0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05；与复方丹参片组比较，＃P＜0.01。

组别 n 梗死灶周边神经细胞凋亡数目 （个／400倍视野）12h 24h 72h正常组6 1.2±1.0 1.3±1.0 1.0±1.1假手术组 6 1.2±1.0△ 1.0±1.0△ 1.0±0.6△模型组 6 37.3±2.7△△ 55.2±6.6△△ 7.2±2.1△△复方丹参片组 6 28.2±2.7＊ 46.8±8.6＊ 6.3±2.7血府逐瘀胶囊A组 6 17.0±3.6＊＃ 28.2±5.9＊＃ 6.0±1.7血府逐瘀胶囊B组 6 16.2±3.6＊＃ 28.0±6.1＊＃6.2±1.9

表3 血府逐瘀胶囊预处理对脑缺血再灌注大鼠梗死灶中心凋亡细胞值的影响 （±s）

表3 血府逐瘀胶囊预处理对脑缺血再灌注大鼠梗死灶中心凋亡细胞值的影响 （±s）

注：与正常组比较，△P＞0.05；与假手术组比较，△△P＞0.05；与模型组比较，＊P＜0.01；与复方丹参片组比较，＃P＜0.05

组别 n 梗死灶中心神经细胞凋亡数目 （个／400倍视野）12h 24h 72h正常组6 1.0±0.6 0.8±1.2 1.0±0.6假手术组 6 1.2±0.9△ 1.7±1.4△ 0.8±0.8△模型组 6 1.2±0.8△△ 1.0±0.6△△ 1.3±1.0△△复方丹参片组 6 4.3±1.2＊ 15.3±2.1＊ 7.2±0.9＊血府逐瘀胶囊A组 6 6.2±1.7＊＃ 19.5±3.0＊＃ 6.7±1.4＊血府逐瘀胶囊B组 6 7.2±1.5＊＃ 16.2±2.3＊ 6.8±1.6＊

3 讨 论

局灶性脑缺血模型 （MCAO模型）是最常用的脑缺血实验动物模型，大脑中动脉是临床缺血性脑血管意外的多发部位，所以MCAO广泛应用于脑缺血相关性疾病的研究［3］。MCAO模型适用于对神经元缺血敏感性、耐受性、再灌注损伤以及治疗最佳时间的研究，是研究缺血性脑损伤及其保护作用相关性研究的工具［4］。神经细胞死亡有坏死和凋亡两种方式，涉及主动和被动细胞死亡机制［5］。细胞凋亡发生最显著的部位是缺血半暗带，神经元凋亡在迟发性神经元死亡中扮演着重要的角色。脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生机制与很多因素有关，比如钙超载、兴奋性氨基酸、氧化自由基增多等，其中较为重要和直接的因素是凋亡细胞内活跃的基因表达。缺血时间对梗死灶中心及缺血半暗带神经细胞的影响程度不同，梗死灶中心区通常以细胞坏死为主；缺血半暗带位于梗死灶周围的低灌注区，如果缺血时间短，血流供应能及时恢复，部分细胞可能恢复正常生理功能；若低灌注持续时间较长，由于血氧及能量供应缺乏，则细胞发生凋亡，使梗死范围进一步扩大。TUNEL法又称DNA断裂的原位末端标记法，此方法可以对凋亡细胞核中DNA分子断裂缺口中的3′-OH进行原位标记，借助荧光显微镜观察，从而判断细胞是否发生凋亡。是目前比较常用也是特异性较强的检测细胞凋亡的方法。

本研究结果显示，血府逐瘀胶囊各组与模型组比较，凋亡率差异有显著性。血府逐瘀胶囊由红花、桃仁、当归等组成，全方具有调气活血作用。血府逐瘀胶囊预处理各组脑梗死灶中心部位的部分神经细胞主要死亡方式为凋亡，而不是坏死，推测可能与该药物具有减轻炎症级联反应的作用有关。血府逐瘀胶囊预处理对梗死灶周围细胞凋亡也有显著抑制作用，可缩小梗死面积，梗死灶中心及缺血半暗带神经细胞的转归与病灶及其周围神经细胞重塑关系密切。上述保护作用可能促进神经元的修复及重塑。因此我们推测，血府逐瘀胶囊预处理重塑脑缺血再灌注后梗死灶可能与参与神经细胞凋亡过程相关，从而得以重塑梗死灶神经组织。

综上所述，血府逐瘀胶囊预处理可通过增强神经元抵抗缺血缺氧能力，调控神经细胞凋亡，从而改善脑缺血再灌注损伤，这可能是其重塑梗死灶、缩小梗死面积的分子机制之一。

［1］刘金芝.血府逐瘀胶囊临床治疗进展［J］.北京中医，2006，25（2）：125-127.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［3］Xi G M，Wang H Q，He G H，et al.Evaluation of murine models of permanent focal cerebral ischemia［J］.Chin Med J，2004，117（3）：389-394.

［4］Feuerstein G Z，Wang X.Animal models of stroke［J］.Mol Med Today，2000，6：133-135.

［5］Ferrer I，Planas A M.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia：life and death struggle in the penumbra［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2003，62（4）：329-339.