微小RNA-7过表达对人肺癌细胞体内外转移的影响

朱顺飞，廖珍媛，胡 燕，陈 超，李永菊，刘思静，罗军敏，熊思东，徐 林

(1.遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 麻醉学系2011级学生，贵州 遵义 563099)

·基础医学研究·

微小RNA-7过表达对人肺癌细胞体内外转移的影响

朱顺飞1，廖珍媛1，胡 燕1，陈 超1，李永菊1，刘思静2，罗军敏1，熊思东1，徐 林1

(1.遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 麻醉学系2011级学生，贵州 遵义 563099)

目的探讨过表达miR-7对人肺癌细胞体内外转移的影响。方法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(命名为p-miR-7)体外瞬时转染人肺癌95D 细胞后，划痕法检测细胞的体外迁移情况；侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变；建立人肺癌裸鼠体内转移模型，HE染色观察过表达miR-7对肺部肿瘤转移的影响；免疫荧光技术检测肿瘤转移相关蛋白Sema4C蛋白的表达。结果过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力(P<0.05)；与对照组相比，过表达miR-7组未观察到明显的肺部肿瘤细胞转移灶(P<0.05)；免疫荧光结果显示，过表达miR-7组中，肿瘤细胞内Sema4C蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞体外及体内的转移能力，提示miR-7有望成为肺癌后续基因治疗的新靶点。

肺癌；miRNA-7；转移；侵袭；Sema4C；生物治疗

微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是miRNA家族成员之一，定位于第15号染色体，已有文献报道其可以有效的抑制乳腺癌和胶质瘤等多种肿瘤的生长和转移[1-2]。新近研究报道显示，miR-7还与肺癌的体外增殖以及临床化疗有关[3]。然而, miR-7参与调控肺癌的侵袭、转移及其相关机制仍未阐明。我们在前期研究中发现，miR-7模拟物(mimics)可以有效抑制人肺癌细胞的体外生长[4]。我们成功构建了miR-7的真核表达载体，其可有效表达miR-7成熟体[5]。因此，本研究拟在前期研究基础上，进一步利用该真核表达载体过表达miR-7，观察miR-7对人肺癌细胞体内、外转移能力的影响，并初步探讨miR-7在肺癌转移过程中的可能作用机制，为后续基于miRNAs的肺癌临床生物治疗新靶点的开发提供前期实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人源性肺巨细胞癌95D细胞株，购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 实验动物 24只4周龄雌性BALB/C裸鼠，购自第三军医大学实验动物中心。

1.3 主要试剂和仪器 细胞培养液RPMI 1640(购自Hyclone公司)；PCR试剂和Premix Ex Taq(Takara)；优质胎牛血清(Solarbio)；L-谷氨酰胺(上海政翔化学试剂研究所)；双抗(氨卞青霉素钠、硫酸链霉素)(上海市第四制药股份有限公司)；LipofectamineTM2000转染试剂盒(invitrogen)；质粒pcDNA3.1(-)(invitrogen)；质粒小抽提取试剂盒(天根)； SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州净化设备厂)；低温台式高速离心机和二氧化碳培养箱(Thermo)；TD5A-WS台式低速离心机(湘仪仪器)；IX-51倒置显微镜和IX-71倒置荧光显微镜(OLYMPUS)；激光共聚焦显微镜(Leica公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养及转染 人肺癌95D细胞用RPMI 1640培养液辅以10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 μg/ mL链霉素,在37 ℃、5% CO2条件下培养。当细胞贴壁度达70%～80%时弃去培养液，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数并离心收集细胞，调整细胞浓度为5×107/mL接种于6孔板中备用。根据脂质体2000试剂说明书，分别将pcDNA3.1(-)-p-miR-7重组质粒(实验组：p-miR-7)和pcDNA3.1(-)空白质粒(对照组：p-Cont)分别转染入至95D细胞。

2.2 划痕实验检测p-miR-7转染后95D细胞的体外迁移 将上述各组转染细胞培养6h后，用1 mL枪头沿板中线刮出2 mm刮痕，PBS洗涤，显微镜下观察确定刮痕内无细胞后，加上培养基，继续培养48 h；吸去培养上清液，每孔加入1 mL4%多聚甲醛，固定30 min，光学显微镜下进行拍照。

2.3 体外侵袭实验 取按照Matrigel：培养基(无血清)=1∶3的比例稀释的Matrigel 50 μL( 120 μg)加入Trans-well的上室，置37 ℃下60 min 凝聚以形成人工基底膜。将上述各实验组细胞消化处理为细胞悬液(用不含血清的RPMI 1640培养液)，分别加入上室中，每室细胞数至少在 2×105个, 置 37 ℃、5% CO2全湿度细胞培养箱培养48 h，并在Trans-well室的下室加入含10%血清的培养基。取出聚碳酸酯膜，4%多聚甲醛固定20 min；伊红染色30 min；乙醇梯度逐级脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。普通光学显微镜下将膜分为9等份，选取4个旁格和1个中心格,计算每个视野下的细胞数, 每组计数3个批次的样品。

2.4 肺癌裸鼠体内转移模型

2.4.1 细胞培养及转染 细胞培养与转染技术步骤同2.1。

2.4.2 尾静脉注射 根据文献[13]报道，24只裸鼠购回后于SPF环境下观察饲养4周后，编号并随机分为两组，每组12只: ①观察各组裸鼠体重变化情况；②观察裸鼠体内肺转移；然后将这两组又分别分为实验组和对照组(其中每组6只裸鼠)，分组完成后，分别从对照组和实验组裸鼠尾部选取较粗的静脉注射p-Cont空白载体和 p-miR-7重组载体,每只裸鼠注射细胞悬液约1 mL。接种后每天观察接种点有无红肿破溃，裸鼠的一般状态(精神、饮食)。

2.4.3 肺转移灶的检测 从裸鼠尾静脉接种人肺癌95D细胞，第28天后,常规处死两组裸鼠,解剖后取其肺部组织并肉眼观察是否有肿瘤转移灶形成。将裸鼠肺组织放入苦味酸液中固定24 h ,后经乙醇梯度逐级脱水，置于60 ℃蜡盒内浸蜡,包埋切片后行苏木精-伊红染色,在显微镜下观察其肺组织形态学变化。

2.4.4 免疫荧光技术检测肿瘤组织中Sema4C蛋白的表达 收集95D细胞，将其转移至专用细胞培养载玻片中培养，并分别转染p-cont空白载体和p-miR-7重组载体，培养条件和转染方法同前。转染48 h后，做免疫荧光染色，步骤如下：弃去培养液，PBS洗1次，用4%多聚甲醛固定30 min, PBS漂洗3次；加含10%牛白蛋白的PBS封闭1 h, 再用PBS漂洗3次；加入含0.5%Triton-x-100的 PBS进行破膜2 min，PBS漂洗3次；滴加Sema4C抗体(稀释倍数均为1∶200)，置于4 ℃湿盒中过夜后，取出用PBS漂洗3次；加入1∶200倍稀释的羊抗兔-FITC二抗，置于37℃湿盒中避光1 h，用PBS漂洗3次；滴加DAPI染液，染色3 min，接着用PBS漂洗3次；滴加pH7.4 50%的缓冲甘油，盖上盖玻片，封片。用激光共聚焦显微镜进行观察、拍片，并分析结果。

3 结果

3.1 瞬时转染p-miR-7抑制95D细胞的体外迁移 p-miR-7载体转染95D细胞后，划痕实验检测细胞体外迁移能力的变化。转染48h后，结果显示：与p-Cont转染组相比，p-miR-7转染组细胞的体外迁移能力受到显著抑制(见图1)，提示过表达miR-7可抑制95D细胞的体外迁移能力。

注：Light microscope(Magnification:×100);B:cell Counts;*:Statistical difference. 图1 转染p-miR-7对人肺癌95D细胞的体外迁移的作用(×100)

3.2 瞬时转染p-miR-7对95D细胞体外侵袭能力的影响 我们进一步利用侵袭实验观察了肿瘤细胞体外侵袭能力的变化。实验结果显示：与p-Cont转染组相比，p-miR-7转染组95D细胞的侵袭能力明显削弱，侵入胶原的细胞数量较p-Cont转染组减少约5倍，差异具有统计学意义(P<0.05，见图2A、B)，提示过表达miR-7可显著抑制95D细胞的体外侵袭能力。

注：Light microscope(Magnification:×100);B:cell Counts;*:Statistical difference. 图2 转染p-miR-7后对人肺癌95D细胞体外侵袭的影响

3.3 人肺癌体内转移模型裸鼠的生长变化 我们进一步建立了人肺癌裸鼠体内转移模型，观察过表达miR-7对裸鼠生长以及肺癌细胞体内转移的影响。结果显示：p-miR-7转染组裸鼠的饮食和精神状态良好；而p-Cont转染组裸鼠饮食下降、精神状态差，且体重明显减轻(P<0.05，见图3)。

图3 各组裸鼠的体重变化

3.4 过表达miR-7对人肺癌细胞体内转移的影响 实验结果显示：与p-miR-7转染组相比，p-Cont转染组裸鼠肺部可见明显的肿瘤细胞转移灶。镜下表现为一群细胞大小不一、核仁明显、核大并深染的不规则裸核。而p-miR-7转染组镜下未观察到明显的肿瘤细胞转移灶(见图4)。

注：箭头示肺部转移的肿瘤细胞。 图4 裸鼠肺组织苏木精-伊红染色结果(×100)

3.5 免疫荧光法检测体外各组肿瘤细胞Sema4c蛋白的表达 为探讨过表达miR-7抑制人肺癌细胞转移的可能机制，我们通过TargetScan软件和Blast比对分析后，发现肿瘤转移相关蛋白Sema4C基因的3’UTR端存在与miR-7结合的位点。为了明确miR-7是否可以调控Sema4C的表达，我们进一步通过免疫荧光技术检测了转染各组中细胞内Sema4C蛋白的表达情况。激光共聚焦结果显示：与p-Cont转染组相比，p-miR-7转染组细胞内Sema4c蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05，见图5)，提示过表达miR-7可抑制肿瘤细胞内转移相关蛋白Sema4C的表达。

图5 免疫荧光法检测人肺癌细胞内Sema4c蛋白的表达(×400)

4 讨论

新近研究显示miR-7与多种肿瘤的发生、发展及转移有关，其中包括乳腺癌、胃癌、肝癌、神经胶质瘤等，并且对于miR-7在上述恶性肿瘤的功能研究也取得了一定进展[3,6-9]。如Okuda等[10]研究发现，miR-7可以通过调节KLF4的表达从而抑制乳腺癌的脑转移；也有研究发现，将miR-7在恶性胶质瘤中过表达，可显著抑制其迁移、侵袭能力，并且其作用机制可能与靶向下调EGFR表达相关[1]；Fang等[11]新近研究显示，miR-7在体内外均可抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力，并可使肝癌细胞阻滞于G0/G1期，其主要作用机制是抑制了肿瘤细胞中PI3K/Akt信号途径的传递。尽管miR-7在这些恶性肿瘤中的表达及其调控机制仍远未阐明，但这些研究结果均提示，miR-7在恶性肿瘤转移过程中可能发挥了抑癌基因的作用，且有望成为一个潜在的肿瘤基因治疗的新靶标。

我们课题组在前期研究中发现，miR-7在正常肺组织中是高表达的[3]，而在临床肺癌组织中，其表达水平显著降低，且miR-7的异常表达(低表达)与临床肺癌的发生、发展和转移密切相关[12]。在本研究中我们进一步利用基于CMV启动子的真核载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7过表达miR-7，发现过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体外侵袭转移能力。更重要的是，我们构建了人肺癌裸鼠体内转移模型，并发现过表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞的体内转移能力。与之一致的是，我们在新近的研究中也发现miR-7可抑制TLR9信号通路促进人肺癌细胞生长和转移[13]。Xiong等研究也报道在肿瘤局部注射miR-7，可以抑制肺癌细胞的体内自发转移[14]。此外，Veerla等[15]研究还显示miR-7的表达水平与膀胱癌的转移和临床分期密切相关。这些研究结果提示，miR-7可能在人肺癌以及其它肿瘤体内转移过程中同样发挥了重要的调控作用。

另外，近年Sema4C蛋白与肿瘤的相关关系也越来越受到关注。既往研究发现，其在肿瘤的发生发展、细胞迁移、血管发生等方面发挥了重要作用。如Jiang等[16]研究发现，Sema4C蛋白可调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用，促进肿瘤淋巴转移；Zhang等[17]研究还发现，下调Sema4C蛋白的表达水平，可明显抑制乳腺癌细胞的体外迁移、侵袭和增殖。但目前有关Sema4C与肺癌之间关系的相关文献报道较少。在本研究中，我们结合生物信息学分析和免疫荧光技术发现，过表达miR-7可显著下调肺癌细胞内Sema4C蛋白的表达，这提示miR-7有可能是通过下调Sema4C蛋白的表达，进而抑制肺癌细胞的转移。据此，我们推测Sema4C基因的激活或过度表达在肺癌的转移中可能具有重要作用，然而，其具体作用及相关机制仍待后续研究阐明。

总之，本研究发现，过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体内、外转移能力，这为后续深入研究miR-7与肺癌发生、转移中的作用及相关机制，以及为进一步临床肺癌基因生物治疗新靶点的开发提供了重要的前期实验和理论依据。

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TheeffectsofmicroRNA-7onthemetastasisofhumanlungcancer95Dcellsinvitroandinvivo

Zhushunfei1,Liaozhenyuan1，Huyan1，Chenchao1，Liyongju1，Liusijing2，Luojunmin1，Xiongsidong1,Xulin1

(1.Department of Immunology and Immunology Innovation Base of Postgraduate Education Department,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China; 2.The major of Anesthesia of 2011 level,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of miR-7 overexpression on the metastasis of human lung cancer cells in vivo and vitro.MethodsThe eukaryotic expression vector of pcDNA3.1 encoding miR-7(termed as p-miR-7) was transiently transfected into human lung cancer 95D cells in vitro. The migration of cells was observed by scratch assay; the invasion of cells was observed by invasion assay. Moreover, human lung cancer metastatic model in nude mice was established. The metastasis of lung cancer cells was observed by HE staining. Finally, the expression of Sema4c was also detected by immunohistochemistry assay.ResultsOverexpression of miR-7 can significantly inhibit the metastasis and invasion of lung cancer cells in vitro (P<0.05). Moreover, compared to the control group, the metastasis of cancer cells in miR-7 overexpression cells was not observed in the lung (P<0.05). Finally, the expression levels of Sema4C protein were also remarkably decreased (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-7 could significantly inhibit the metastasis of human lung cancer cells in vivo and vitro, indicating a new target for subsequent lung cancer gene therapy.

lung cancer;miRNA-7;metastasis;invasion;sema4C; biotherapy

国家自然科学基金项目(NO:81260398)；教育部新世纪优秀人才计划项目(NO:NCET-12-0661)；贵州省国际合作项目(NO:10C315)。

徐林，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤免疫,E-mail:xulinzhouya@163.com。

R737.33

A

1000-2715(2013)05-0401-05

[收稿2013-07-27;修回2013-09-12]

(编辑：谭秀荣)