碘伏对结核杆菌标准菌株及耐多药临床菌株的杀灭效果研究

孙 巍 谈 智 徐 燕 吴晓松 王 嵬

江苏省疾病预防控制中心，南京 210009

结核是世界上最古老、分布最广泛的疾病之一，曾严重危害人类的健康。近年来由于人口流动以及多发耐药菌株增多等多种因素，结核病再次成为全球关注的重要公共卫生问题和社会问题，WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。我国是世界上22个结核病高发国家之一，居全球第二位，结核分枝杆菌感染导致的疾病一直严重威胁着人类的健康，仍然是我国重点防治的重大传染性疾病[1～3]。

当前结核病感染发病率高，病死率高、耐药等原因导致治愈率低。杀灭自然环境中结核杆菌是控制结核病发生的重要环节。目前国内外相继出现了大量的结核分枝杆菌引起医院内感染的报道，而引起医院内感染增加的原因，除了生物因素、环境因素和营养因素外，医院消毒的不合理、不规范也是一个重要原因，消毒剂不合理使用，在杀灭细菌的同时，也诱导其产生对消毒剂的抗性，尤其是2003年SARS危机后，盲目使用消毒剂，不仅造成了消毒剂的浪费，环境的污染，同时也造成了一些微生物对消毒剂抗性的产生，研究资料表明，医院感染病原体的耐受现象已不仅仅局限于抗生素，开始扩展到了消毒剂。且随着消毒剂的大量使用变得越来越广泛，后果也越来越严重，尤其在医院感染的传播中，对消毒剂的耐受可能是重要因素之一[3～5]。

因此，本研究选择医院常用消毒剂碘伏为研究对象，观察碘伏作用结核杆菌标准菌株以及从临床病人中分离出来的耐多药的菌株的杀灭效果，了解结核杆菌对常用消毒剂的抗性变化，并对6株细菌进行耐消毒剂基因的分子生物学检测。

材料与方法

试验材料

1. 试验菌株

结核杆菌标准菌株H37Rv（中国疾控中心国家结核病参比实验室），结核杆菌标准菌株H37Ra（中国疾控中心国家结核病参比实验室），结核杆菌临床分离耐多药菌株：耐多药菌株a（利福平、异烟肼耐药）；耐多药菌株b（利福平、异烟肼、乙胺丁醇耐药）；耐多药菌株c（利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药）；耐多药菌株d（利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药）（江苏省疾病预防控制中心结核实验室提供）。

2. 消毒液

碘伏消毒液（聚乙烯吡咯烷酮碘，有效碘含量为5.4g/L）。

3. 试剂

5g/L硫代硫酸钠、10g/L吐温-80的TSB液，3%牛血清白蛋白，改良罗氏培养基等。

4. 器材

机械秒表（504型），恒温恒湿培养箱（热电-710L）等。

方法

1.菌悬液的制备

1）结核杆菌标准菌株H37Rv

在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐温-80水溶液，用无菌吸管尖端或火焰消毒的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，至于磨菌瓶中；注意尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑取1～2个单独菌落进行试验，刮取菌落的量以半环或一环（5mg～10mg）为宜；旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡10～30秒；静置5分钟，小心打开瓶盖，加入约2毫升灭菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液，约1毫升，转移到另一无菌试管中，与麦氏比浊管比浊；逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即得到1mg/mL的菌液；上述操作需在Ⅱ级或Ⅱ级以上生物安全操作柜中进行。

2） 结核杆菌标准菌株H37Ra

同1）步骤。

3）结核杆菌临床分离耐多药菌株

同1）步骤。

2. 中和剂选择试验

参照消毒技术规范（2002版）[2]，设平行6组试验，按悬液定量杀菌试验程序进行。

1）消毒液+菌悬液；

2）（消毒液+菌悬液）+中和剂；

3）中和剂+菌悬液；

4）（消毒液+中和剂）+菌悬液；

5）稀释液+菌悬液（正常菌对照）；

6）稀释液+中和剂+培养基作为阴性对照。

试验结果，以第1组不长菌或仅有极少数菌落生长；第2组有菌落生长，较第1组为多，但较第3、4、5组为少；第3、4、5组组间菌落数在1×107CFU/mL ～ 5×107CFU/mL，误差率不超过15%；第6组无菌生长。表明所选中和剂及其浓度适宜。

3. 悬液定量杀菌实验

用无菌硬水配制试验浓度的碘伏消毒液（阳性对照为稀释液），取0.5mL菌悬液和0.5mL有机干扰物（3%牛血清白蛋白）在20℃±1℃水浴5min，再加入4.0mL消毒液，作用一定时间，取0.5mL混和液加入4.5mL中和剂，中和作用10min，取0.1mL加入改良罗氏平板培养基，用L棒涂抹均匀，培养1个月。试验重复3次。

4. 耐消毒剂基因的检测

1）qacE△1-sulI基因检测

引物P1：5’-T AGCGAGGGCTTT ACCT AAGC-3’，P2：ATTCAGAATGCCGAACACCG，扩增产物长度300bp，引物由TAKARA宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应体系如下：

反应：体积25uL，dNTPs的浓度各为200Lmol/L，引物浓度均为0.6Lmol/L，含TaqDNA聚合酶2U, 10倍的反应缓冲液2.5uL，DNA模板为3uL。93℃预变性2min后，进行35个循环, 每次循环93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s。35次循环结束后于72℃延伸5min。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳30min，电压110V，观察结果。

2）qacA/B基因检测

引物P1：5’- CT A TGGCAA T AGGAGA T A TGGTGT-3’，P2：5’- CCACT ACAGA TTCTTCAGCT ACA TG-3’，产物长416bp。引物由TAKARA宝生物工程（大连）有限公司合成。

PCR反应体系及电泳条件：同1）。

结果

中和剂鉴定试验

结果表明，含5g/L硫代硫酸钠、10g/L吐温-80的中和剂，可以有效中和含有效碘1000mg/L浓度的消毒液对龟分枝杆菌脓肿亚种的残留作用，中和剂及其产物对试验菌生长和培养基无不良影响，符合有效中和剂结果判定要求。含5g/L硫代硫酸钠、5g/L吐温-80的中和剂，可以有效中和含有效碘500mg/L浓度的消毒液对结核杆菌标准菌株H37Rv和H37Ra的残留作用，中和剂及其产物对试验菌生长和培养基无不良影响，符合有效中和剂结果判定要求（见表1）。

对结核杆菌标准菌株H37Rv的杀灭效果

研究结果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用7min，有效碘250mg/L的消毒液作用3min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min对结核杆菌标准菌株H37Rv杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加、作用时间延长，杀灭效果逐渐递增（见表2）。

对结核杆菌标准菌株H37Ra的杀灭效果

研究结果表明，含有效碘250mg/L的消毒液作用5min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min，对结核杆菌标准菌株H37Ra杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加、作用时间延长，杀灭效果逐渐递增（见表3）。

对多株临床分离的多株耐多药菌株的杀灭效果

1. 耐多药菌株a（利福平、异烟肼耐药）；

研究结果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用1min 、500mg/L的消毒液作用1min，对耐多药株a杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加、作用时间延长，杀灭效果逐渐递增（见表4）。

表1 中和剂鉴定试验结果

表2 对结核杆菌标准菌株H37Rv杀灭效果

表3 对结核杆菌标准菌株H37Ra杀灭效果

2. 耐多药菌株b（利福平、异烟肼、乙胺丁醇耐药）

研究结果表明，含250mg/L的消毒液作用1min，对耐多药株b杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加，杀灭效果逐渐递增，作用时间的影响相对较小（见表5）。

3. 耐多药菌株c（利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药）；

研究结果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，对耐多药菌株c杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加、作用时间延长，杀灭效果逐渐递增（见表6）。

4.耐多药菌株d（利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药）

研究结果表明，含有效碘125mg/L的消毒

液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，对耐多药菌株d杀灭对数值＞4.00。且随着有效浓度增加、作用时间延长，杀灭效果逐渐递增（见表7）。

表4 对耐多药菌株a杀灭效果

表5 对耐多药菌株b杀灭效果

表6 对耐多药菌株c杀灭效果

耐消毒剂基因的检测

1. 经PCR检测证明，2株标准菌株和4株临床分离的耐多药菌株的qacE△1-sulI基因的PCR检测，标准菌株H37Rv、耐多药菌株a、耐多药菌株b为阳性，阳性率50%（见图1）。

2. 经PCR检测证明， 2株标准菌株和4株临床分离的耐多药菌株的qacA/B基因PCR检测皆为阴性，均未检测到抗消毒剂基因。

讨论

目前，用于结核病治疗的一线药物主要有：利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇等，其中，利福平和异烟肼是应用于临床的主要药物，至少对这两种药物耐药，评判该临床菌株为耐多药菌株，因此，本研究选取结核杆菌标准菌株H37Rv、结核杆菌标准菌株H37Ra、以及4株耐多药菌株为代表。而碘伏广泛应用于临床消毒，属于广谱、中效消毒剂，其杀菌作用较强，作用速度快，且对皮肤黏膜刺激较小[6]。

图1 qacE△1-sulI基因PCR电泳图

表7 对耐多药菌株d杀灭效果

本研究结果表明，含有效碘250mg/L作用5min、500mg/L作用1min，对结核杆菌标准菌株H37Rv杀灭对数值＞4.00，含有效碘500mg/L作用1min，对结核杆菌标准菌株H37Ra杀灭对数值＞4.00，含有效碘250mg/L作用3min，对4株耐多药菌株杀灭对数值均＞4.00。可见，碘伏消毒液对结核杆菌标准菌株以及耐多药菌均有良好的杀菌作用，可以提倡应用于医院及高危环境中医护人员或病人及家属的皮肤表面的消毒，可减少交叉感染，降低及医院感染的发生，有效控制结核病的传播和流行。

经PCR检测证明，2株标准菌株和4株临床分离的耐多药菌株的qacE△1-sulI基因的PCR检测，标准菌株H37Rv、耐多药菌株a、耐多药菌株b为阳性，阳性率50%。耐消毒基因qacA/B基因的PCR检测皆为阴性，均未检测到该抗消毒剂基因。

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