艾蒿提取物对烟草病原菌的抑制作用

李超影,胡国元,胡坚,杨春雷,余君,杨锦鹏,袁军

(1.武汉工程大学化工与制药学院,绿色化工过程教育部重点实验室,湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室,湖北 武汉 430074;2.湖北省烟草科研所,湖北 武汉 430030)

0 引言

植物源农药在我国已成为一类重要的农药[1],植物源农药的研究和开发具有广阔的前景和重要的价值.近年来,植物源农药在烟草病害防治方面的报道较多,6种中草药的提取物生物碱类、苷类、挥发油类、糖类、黄酮类、香豆素类对烟草疫霉菌均有明显的抑制作用[2];藜芦、博落回、苦参、艾的乙醇提取物对烟草赤星病也均有防治效果[3];大蒜乙醇提取物、13种热带药用植物乙醇提取物对烟草青枯病有明显的防治效果[4-5].

菊科植物在抑菌、杀菌活性方面的研究已有大量报道[6-8],菊科植物提取物对一些植物病原菌物有一定的抑菌效果,具有开发为新型植物源农药的潜力.目前,利用菊科植物提取物防治烟草病害的报道较少,本文中以艾蒿(Artemisiaargyilevl. et vant)为实验材料,测定了其乙醇提取物对烟草疫霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、烟草链格孢菌(Alternariaalternata)、烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)3种烟草病原菌的抑制作用.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及来源 艾蒿(Artemisiaargyilevl. et vant),地上部分,主要是茎和叶;由湖北省烟草科研所提供.

1.1.2 供试菌株及来源 烟草疫霉菌(P.parasiticavar.nicotianne);烟草链格孢菌(A.alternata);烟草青枯病菌(R.solanacearum),3种菌株均由湖北省烟草科研所提供,笔者实验室保存.

1.1.3 培养基 马铃薯蔗糖琼脂(Potato Sucrose Agar,PSA)培养基:马铃薯20%,蔗糖2%,琼脂1.8%,蒸馏水,pH自然;用于烟草链格孢菌的活化与培养.

燕麦琼脂(Oatmeal Agar,OA)培养基:燕麦片2%,迹量盐溶液(FeSO4·7H2O 0.1 g,MnCl2·4H2O 0.1 g,ZnSO4·7H2O 0.1 g,蒸馏水100 mL)0.1%,琼脂1.8%,蒸馏水,pH 7.2;用于烟草疫霉菌的活化与培养.

BPY(Beef extract Prptone Yeast extract)培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,酵母抽提物0.05%,葡萄糖1.0%,蒸馏水,pH 7.0;用于烟草青枯病菌的摇瓶活化.

BPA(Beef extract Prptone Agar)培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,酵母抽提物0.05%,葡萄糖1.0%,琼脂1.8%,蒸馏水,pH 7.0;用于烟草青枯病菌的活化与培养.

1.1.4 药品 无水乙醇,石油醚(60-90),乙酸乙酯,氯仿,葡萄糖,七水硫酸亚铁,四水氯化锰,七水硫酸锌,均为分析纯、市售;琼脂(040010,Japan),牛肉膏(北京双旋微生物培养基制品厂),蛋白胨(北京双旋微生物培养基制品厂),酵母抽提物(OXOID)等.

1.2 方法

1.2.1 植物材料的预处理 将艾蒿的茎和叶40 ℃烘干,粉碎过孔径为0.15 mm筛子(100目),密封,置于干燥器中,备用.

1.2.2 植物材料的浸提 取预处理后的艾蒿20 g于三角瓶中,加入100 mL无水乙醇,密封后于恒温(40 ℃)摇床中震荡浸提3 d.经布氏漏斗加压抽提后,利用旋转蒸发仪40 ℃减压浓缩,用无水乙醇定容至20 mL,相当于每毫升含1.0 g生药提取物,记生药浓度为1.0 g·mL-1.密封保存于冰箱(4 ℃)中,备用[8].

1.2.3 植物提取物的萃取 取冰箱中备用的艾蒿浸提物并浓缩成浸膏,加五倍量蒸馏水,在40 ℃的水浴锅中热溶3～4 min,装入分液漏斗中,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯各萃取3次(与水溶液等体积/次),各萃取液利用旋转蒸发仪40 ℃减压浓缩得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物,加无水乙醇定容至20 mL,记生药浓度为1.0 g·mL-1.密封保存于冰箱(4 ℃)中,备用[9].

1.2.4 孢子悬浮液的制备 将活化后的烟草链格孢菌转移至PSA培养皿中央,28 ℃恒温培养至产孢,用无菌水洗下孢子,用4层纱布过滤后得到孢子悬液.在显微镜下(10×10倍)检查孢子数,以无菌水稀释至每视野30～50个孢子[10],放在4 ℃冰箱中备用.

1.2.5 青枯菌悬液的制备 将烟草青枯菌接种于BPA斜面上,置于28 ℃恒温箱中培养24 h,在超净工作台上,用接种环挑取菌苔于无菌生理盐水中稀释,稀释成106～108CFU/mL的菌悬液[11],置于4 ℃冰箱中备用.

1.2.6 菌丝生长速率法 在PSA、OA培养基中加入1.0 g·mL-1的生药液,使其在培养基中的浓度为50、100 mg·mL-1,然后倒入培养皿中,在培养皿中心接种直径7.68 mm菌饼.以等量的无水乙醇作为对照,每处理重复3次,28 ℃恒温培养,在一定时间观察记录菌丝生长情况,十字交叉法测量菌落生长直径,用下述公式计算菌丝生长抑制率[8,12-13].

菌丝生长抑制率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100.

1.2.7 孢子萌发法 往干燥洁净的无菌凹玻片凹孔中滴加40 μL的浓度为50、100 mg·mL-1的生药液,在超净台上挥发至干;然后每孔滴加40 μL配制好的孢子悬浮液,28 ℃恒温保湿培养6 h,显微镜下观察并记录孢子萌发情况,以等量的无水乙醇为对照,且对照组孢子萌发率达80%以上,每处理重复3次[8,10,13].按下面公式计算抑制孢子萌发率:

孢子萌发率/%=萌发孢子数/孢子总数×100,

抑制孢子萌发率/%=(对照组萌发率-处理组萌发率)/对照组萌发率×100.

1.2.8 滤纸片法 在BPA平板上加入200 μL细菌悬浮液并涂布均匀.取植物醇提物生药液并用无水乙醇稀释至50、100、200 mg·mL-1,将灭菌后的滤纸片于3个浓度的艾蒿乙醇提物生药液稀释液中浸泡20 min,后风干,以无水乙醇作对照.然后用无菌镊子夹取，将含药滤纸片贴于细菌营养平板上,并轻轻按压使充分接触,每个处理重复3次,置28 ℃恒温培养箱培养,24 h后用十字交叉法测量抑菌圈直径,求平均值[5].

1.2.9 数据分析方法 采用Microsoft Excel 2003软件进行数据分析.

2 结果与分析

2.1艾蒿乙醇提取物对真菌菌丝生长的抑制作用由表1可知,50 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物对烟草链格孢菌和烟草疫霉菌菌丝的最高抑制率分别为18.51%(168 h)、100.00%(96 h);100 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物对烟草链格孢菌菌丝的最高抑制率为58.84%(48 h);艾蒿乙醇提取物对烟草链格孢菌和烟草疫霉菌菌丝的抑制作用随着时间的延长逐步下降,相比而言,艾蒿乙醇提取物对烟草疫霉菌菌丝的抑制作用下降幅度减小,168 h时最低,但还能达到92.33%(图1、2).

图1 不同浓度的艾蒿乙醇提取物在168 h时对烟草链格孢菌菌丝生长的抑制作用a、b中左为对照组,右为加药组,a、b加药组生药含量分别为50 mg·mL-1、100 mg·mL-1.

图2 艾蒿乙醇提取物在120 h时对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制作用左为对照组、右为加药组,加药组生药含量为50 mg·mL-1.

供试菌株培养时间/h菌落直径/cm抑菌率/%50 mg·mL-1100 mg·mL-1CK加药组CK加药组50 mg·mL-1100 mg·mL-1链格孢菌48——23.52±0.6114.20±0.86—58.8472——30.63±0.8519.97±0.96—46.459623.19±0.5627.97±1.3037.37±1.2725.30±0.72-30.8240.65120——44.47±1.0031.48±0.23—35.3114446.20±1.2139.91±1.1252.89±1.5237.29±0.8716.3334.5116855.22±1.6246.42±1.3361.42±1.8242.00±0.3918.5136.14烟草疫霉9631.61±0.487.68±0.00——100.00—12063.40±4.008.79±0.09——98.01—14474.38±2.5710.99±0.70——95.04—16882.17±0.3813.39±0.18——92.33—

“—”表示数据未测定,全文同.

2.2艾蒿乙醇提取物的有机溶剂萃取物对真菌菌丝生长的抑制作用由表2可知,100 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物对烟草链格孢菌菌丝的最高抑制率分别为26.11%(96 h)、32.87%(48 h)、57.17%(72 h);50 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物对烟草疫霉菌菌丝的最高抑制率分别为79.49%(120 h)、87.42%(72 h)(图3、4).

表2 艾蒿乙醇提取物不同有机溶剂萃取物对烟草链格孢菌和烟草疫霉菌菌丝生长的影响

图3 艾蒿有机溶剂萃取物在144 h时对烟草链格孢菌菌丝生长的抑制作用a、b、c中左为对照组、右为加药组,a、b、c加药组中分别添加石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相,浓度为100 mg·mL-1.

图4 艾蒿有机溶剂萃取物在144 h时对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制作用a、b中左为对照组、右为处理组,a、b加药组中分别添加石油醚相、乙酸乙酯相,浓度为50 mg·mL-1.

2.3艾蒿乙醇提取物及其有机溶剂萃取物对真菌孢子萌发的抑制作用由表3可知,在50、100 mg·mL-1的生药浓度下,艾蒿乙醇提取物对烟草链格孢菌孢子萌发的抑制率分别为为76.26%、100.00%;在100 mg·mL-1的生药浓度下,艾蒿乙醇提物的氯仿萃取物对烟草链格孢菌孢子萌发的抑制率为80.05%.

表3艾蒿乙醇提取物及其有机溶剂萃取物对烟草链格孢菌孢子萌发的影响

生药及浓度实验组别孢子萌发率/%萌发抑制率/%醇提物50 mg·mL-1CK90.07加药组21.3876.26醇提物100 mg·mL-1CK88.80加药组0100.00氯仿萃取物100 mg·mL-1CK84.60加药组16.8880.05

培养时间:6 h

图5 艾蒿乙醇提取物对烟草青枯菌的抑制作用0号滤纸片为对照组,1、2、3号滤纸片含药浓度分别为50、100、200 mg·mL-1.

W供试材料药液浓度/(mg·mL-1)CK50100200植物醇提物————

“—”表示无抑菌圈,滤纸片直径为6.0 mm

2.4艾蒿乙醇提取物对烟草青枯菌的抑制作用由表4、图5可知,50、100、200 mg·mL-1艾蒿乙醇提取物对烟草青枯菌均无抑制作用.

3 讨论

1) 艾蒿醇提物对烟草链格孢菌菌丝生长抑制率,随着浓度的提高,呈上升趋势;100 mg·mL-1的生药浓度下,对烟草链格孢菌菌丝的抑制效果较好.

2) 艾蒿醇提物对烟草疫霉菌菌丝的生长有很好的抑制作用,具有开发针对烟草疫霉菌的植物源农药的前景.

3) 艾蒿醇提物中对烟草链格孢菌菌丝起抑制作用活性成分主要存在于氯仿萃液中,与李刚[9]研究的另一种菊科植物臭蒿的实验结果相似.根据相似相容原理,活性成分易溶于氯仿,与氯仿的极性相似,具体活性成分,有待进一步深入研究.

4) 艾蒿醇提物中对烟草疫霉菌菌丝起抑制作用的活性成分分散于石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物中,根据相似相容原理,活性成分易溶于石油醚、乙酸乙酯,与石油醚、乙酸乙酯的极性相似.出现此现象有两种可能:a.活性物质为单一成分,既易溶于石油醚又易溶于乙酸乙酯;b.活性物质为复合成分,有的易溶于石油醚,有的易溶于乙酸乙酯.具体情况,有待探讨.

5) 艾蒿醇提物及其醇提物的有机溶剂萃取物对烟草链格孢菌孢子萌发有较好的抑制作用,与李玉平[6]的实验结果(部分菊科植物对真菌孢子萌发有极强的抑制活性)相似，为艾蒿醇提物用作于杀菌剂,提供了又一理论支持.

6) 艾蒿醇提物对烟草青枯菌无抑制作用,有两种可能:a.艾蒿乙醇提取物中没有针对烟草青枯菌起抑制作用的活性成分;b.艾蒿乙醇提取物对烟草青枯菌的MIC大于200 mg·mL-1.

7) 带毒培养基中含有乙醇、有机溶剂,对抑菌率的测定有影响,将配制的带毒培养基和对照培养基在同等条件下放置一段时间,挥发去其中的大部分乙醇、有机溶剂后再接菌饼,可得到较好的实验效果[8].

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