超声提取/气相色谱－质谱法测定海洋生物中的多环芳烃

孙闰霞，柯常亮，林 钦*，石凤琼

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所 广东省渔业生态环境重点实验室 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300;2.上海海洋大学 海洋科学学院，上海 201306)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs)是一类广泛存在于环境中具有两个或两个以上苯环的持久性有机污染物，主要来源于煤、石油等矿物燃料和其他有机物质的不完全燃烧和热解［1－3］。大部分PAHs对生物都有不利影响，如免疫毒性、致癌、致畸、致突变效应等，还被证实具有环境内分泌干扰物的作用［4－5］。海洋环境中的PAHs主要来自石油泄漏、污水排放、大气沉降以及地表径流等途径［6］。这些污染物很容易在鱼、贝类等海洋生物体中蓄积，并最终通过食物链影响人类健康。一般人群(不包括吸烟者和职业暴露人群)PAHs饮食摄入量占其总暴露量的90%以上［7］;鱼类等海产品虽只占人类饮食的10%左右，却是这些污染物进入人体的重要途径［8］。近年来，随着海洋污染的加剧，海洋生物体中PAHs的监测越来越引起人们的重视，它不仅能反映水体的实时污染状况，还与人类健康密切相关。

目前，PAHs的测定方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱－质谱法(GC－MS)等。其中，GC－MS由于其选择离子(SIM)技术在复杂基质和多组分分析上的优势而得到较为广泛的应用。研究对象大多集中于大气、土壤、沉积物和水体等环境样品［9－13］，而对生物体中PAHs残留分析的研究相对较少。对于已有的分析方法，前处理主要为索氏提取或皂化后有机溶剂萃取等。国家水产行业标准SC/T 3042－2008采用皂化后有机溶剂萃取GC－MS法测定水产品中16种PAHs，但该方法不仅净化步骤繁琐，有机溶剂消耗多，而且取样量大(50 g湿样)。与常见水产经济种类相比，海洋野生生物样品的采集存在一定困难，样品量也常受限制，通常无法直接采用该方法进行测定。索氏提取是一种经典的固体样品提取方法，因其理想的回收率而被大量用于海洋生物样品PAHs的分析中，但该方法耗时较长(约20 h)，不适合大批量样品的处理［14－16］。因此，快速、高效、便捷的样品前处理方法成为海洋生物样品中PAHs分析的迫切需要。目前已有一些学者在鱼类、贝类、蟹类等生物样品中PAHs的分析上尝试采用微波辅助提取［17］、加速溶剂萃取［18－19］、超临界流体提取［20］、基质固相分散萃取［21－22］、分散固相萃取［23］等新型样品提取方法。

超声提取法是一种高效、快速、简单的有机污染物萃取技术，已被广泛用于土壤和沉积物样品中PAHs的分析［11，24－25］，而对鱼类等生物样品的相关研究却鲜有报道，仅有少量针对贝类组织的简单研究［24，26－27］。与微波辅助提取、加速溶剂提取和超临界流体提取等方法相比，超声提取在常温、常压下进行，免去了高温、高压对某些目标成分的影响，便于实现，成本较低［24］。同时，超声波能增加溶剂的穿透力从而进入细胞内部，相较于分散固相萃取等简单的有机溶剂提取，超声提取法对于实际样品中PAHs的分析更有优势。本文选取鱼类、虾类、贝类和蟹类等常见海洋生物种类为测定对象，建立了超声提取/气相色谱－质谱法快速测定海洋生物体中16种美国环保局(USEPA)优先控制的PAHs的分析方法，对样品提取、净化和色谱质谱条件进行了优化，并将该方法成功应用于实际样品中PAHs的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890A－5975C气相色谱－质谱联用仪(美国Agilent公司);Laborota 4000型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司);DL6000B低速冷冻离心机(中国安亭科学仪器厂);KQ5200DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XW－80A漩涡混合器(上海精科实业有限公司);玻璃层析柱(200 mm×10 mm i.d.)。

16种PAHs混合标准样品和内标苊-D10，菲-D10，-D12，苝-D12(美国Supelco公司)，均以正己烷为溶剂配制成质量浓度为200 mg/L的标准储备液，4℃密封避光保存;二氯甲烷、正己烷(色谱纯，Tedia公司);硫酸(优级纯);无水硫酸钠(分析纯，广州化学试剂公司):使用前600℃烘干4 h，冷却后于干燥器中保存;中性氧化铝(层析纯，200～300目):400℃烘4 h，冷却后加4%纯水活化，于干燥器中保存;硅镁型吸附剂(弗罗里硅土，层析纯，60～100目):130℃烘12 h，冷却后于干燥器中保存;硅胶(层析纯，100～200目):140℃烘4 h，冷却后于干燥器中保存。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30.0 m×250.0 μm i.d.×0.25 μm);进样口温度:290℃;程序升温:柱初始温50℃，保持1 min，再以20℃·min－1升至100℃，然后以10℃·min－1升至210℃，保持1 min，最后以5℃·min－1升至290℃，保持5 min;载气:氦气，流速1.3 mL·min－1;进样方式:脉冲不分流进样;进样量:1 μL。

1.2.2 质谱条件 电子轰击离子源模式(EI)，离子源温度230℃，接口温度280℃，四极杆温度150℃，电子轰击能量70 eV，选择离子监测(SIM)方式，16种PAHs的保留时间、特征离子和定量离子以及相应的内标物见表1。

表1 16种多环芳烃的保留时间、定性和定量离子、内标物、线性方程、相关系数及检出限Table 1 Retention times，qualitative ions，quantitative ions，internal standards，linear equations，correlation coefficients(r)and detection limits(LODs)of 16 PAHs

1.3 实验方法

将海洋生物样品(带鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、海鳗、大黄鱼、牡蛎、梭子蟹、虾姑、对虾等)用海水清洗，取肌肉组织匀浆。称取已制成均匀肉糜的样品5.00 g，加入5.0 g无水硫酸钠研磨均匀后将样品置于50 mL具塞离心管中，加入100 μL 1 mg/L内标使用液和20 mL环己烷－二氯甲烷(2∶1)溶液，漩涡混合后超声萃取30 min，以4 800 r/min离心3 min，将上清液转移至100 mL鸡心瓶内。重复超声萃取1次，合并上清液，于旋转蒸发仪上40℃浓缩至近干。用4 mL正己烷分2次清洗鸡心瓶并转移至离心管中，用适量60%的硫酸溶液清洗提取液数次至硫酸层无色。5 500 r/min离心5 min，取有机相缓慢加入层析柱上。采用正己烷湿法装柱，层析柱从上到下依次为3 cm无水硫酸钠、3 cm中性氧化铝、3 cm弗罗里硅土。先用5 mL正己烷淋洗弃去，然后用40 mL正己烷－二氯甲烷(4∶1)洗脱，收集洗脱液，于旋转蒸发仪上40℃浓缩至近干。用正己烷定容至1 mL，转移至棕色进样瓶中，待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱条件的优化

实验发现进样方式、进样口温度、柱温、载气流速、离子源温度等对PAHs各组分的保留时间和分离度有很大影响。PAHs中的高沸点组分不易气化，通过将进样口温度由260℃升至290℃不仅可提高其响应值还可降低进样口污染。脉冲不分流进样促使样品快速从进样口进入色谱柱，减少了样品在进样口分解的同时提高了方法的灵敏度。选择性降低程序升温速率有利于菲和蒽、苯并［a］蒽和 以及苯并［b］荧蒽、苯并［k］荧蒽和苯并［a］芘等同分异构体的分离，合适的载气流速可节约样品分析时间，并提高分离效率和改善峰形。在无杂质干扰的情况下，选择基峰和丰度较高的碎片离子采用选择离子监测模式(SIM)分时段分组监测，提高了方法灵敏度。以样品的色谱保留时间和质谱特征离子及其相对丰度进行定性，以保证方法的准确性。优化后的色谱质谱条件见“1.2”。在优化条件下，100 μg/L的16种PAHs及内标物混合标准溶液和20 μg/kg加标水平下鱼肉样品的选择离子色谱图见图1。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂种类的选择 通常用于提取生物样品中PAHs的溶剂有正己烷、二氯甲烷、丙酮、苯及其混合溶液［17，19，23，27］。为了达到提取效率最大化、提取液中干扰物质最小化以及绿色环保的目的，比较了3种不同体积比的正己烷－二氯甲烷混合溶剂(4∶1，2∶1，1∶1)对样品中PAHs的提取效果(见图2)。由图2可知，4∶1正己烷－二氯甲烷对萘、苊烯等2～3环PAHs的提取效果较好，但同时提取出的脂肪及其他杂质成分较多。正己烷－二氯甲烷(1 ∶1)对茚并［1，2，3-cd］芘、二苯并［a，h］蒽等5～6环PAHs提取有优势，干扰物质较少，但对2～4环PAHs的回收率相对较差。溶剂提取能力的大小取决于溶剂消弱目标物和基体间作用力的能力以及溶质在提取溶剂中的溶解度。正己烷－二氯甲烷混合溶液的极性随着二氯甲烷比例的升高而增加，而PAHs中高环组分具有一定极性，根据相似相溶原理，增大溶剂中的二氯甲烷比例，可更容易提取极性较大的高环组分。由于体积比为2∶1时正己烷－二氯甲烷溶液对16种PAHs的平均回收率均较理想(回收率为74%～113%)，因此本实验最终选择正己烷－二氯甲烷(2∶1)为最佳提取溶剂，用于后续海洋生物样品中PAHs回收率的研究。

图2 不同比例正己烷－二氯甲烷混合溶剂(4∶1，2∶1，1∶1)对样品中PAHs的提取效果Fig.2 Effect of different ratio of n-hexane to dichloromethane on extraction recoveries of PAHs in fish tissues sample

2.2.2 提取溶剂用量的选择 以正己烷－二氯甲烷(2∶1)溶液为提取试剂，考察了不同提取体积对提取效果的影响。分别使用15、20、30 mL正己烷－二氯甲烷(2∶1)对每个试样重复提取2次，按照本方法进行净化和测定。结果表明，提取溶剂用量为15 mL时，16种PAHs的提取效率较低;而用量为20 mL和30 mL时，16种PAHs的提取效率接近，其回收率分别为74%～105%和71%～112%。因此，实验选择提取溶剂的最佳用量为20 mL。

2.3 净化条件的优化

2.3.1 净化方法的选择 生物样品的净化有利于提高方法的检出限并延长仪器使用寿命。脂类物质是生物样品中PAHs分析的主要干扰物质，浓硫酸对脂肪具有很好的去除作用，但会造成PAHs多种组分不同程度的损失［19］。根据前期研究［19－20，23，28］，本研究实验了多种净化方案，如基质固相分散、60%硫酸处理和层析柱净化。结果表明，提取液依次经60%硫酸和层析柱净化后，脂肪的去除效果最佳，硫酸用量与脂肪含量有关。随后，考察了不同层析柱填料对净化效果的影响。弗罗里硅土、硅胶和中性氧化铝是生物体PAHs净化中常用的3种吸附剂，目前已有研究发现弗罗里硅土和硅胶对鱼类组织PAHs提取物具有理想的净化效果［17］。中性氧化铝对脂肪具有很好的吸附性，但一般不单独使用。本实验考察了弗罗里硅土、硅胶、中性氧化铝－弗罗里硅土(体积比1∶1)、中性氧化铝－硅胶(体积比1∶1)4种不同填料层析柱的净化效果，结果见图3。由图可知，硅胶层析柱对样品中杂质的去除效果最差，杂峰较多且峰高较大;其次为中性氧化铝－硅胶和弗罗里硅土;中性氧化铝－弗罗里硅土复合层析柱处理后的样品色谱图最干净，杂质的去除效果最好。这可能不仅与吸附剂的吸附特性有关，还受吸附剂用量的影响。实验发现，相同体积的填料，硅胶、弗罗里硅土、中性氧化铝的质量依次增加。因此，最终选用中性氧化铝－弗罗里硅土复合层析柱。

图3 弗罗里硅土(A)、硅胶(B)、中性氧化铝－弗罗里硅土(1∶1，C)和中性氧化铝－硅胶(1∶1，D)4种层析柱净化后的样品色谱图Fig.3 Selective ion monitoring(SIM)chromatograms of the biological samples purified by Florisil(A)，silica gel(B)，neutral aluminum oxide and Florisil(1 ∶1，C)，neutral aluminum oxide and silica gel(1 ∶1，D)

2.3.2 洗脱剂用量的选择 不同体积比的正己烷－二氯甲烷溶液对PAHs的洗脱效果不同。正己烷比例高，则洗脱液的用量大，而二氯甲烷的比例高，则洗脱杂质多［21］。本实验选定4∶1正己烷－二氯甲烷溶液为洗脱剂，采用PAHs标准溶液分别考察了体积用量分别为30、35、40、50 mL时的洗脱效率。实验发现，当洗脱剂用量为30 mL和35 mL时，苯并［a］芘、茚并［1，2，3-cd］芘、二苯并［a，h］蒽、苯并［g，h，i］苝和内标苝-D12等部分高环组分出现色谱峰丢失或峰面积偏低现象，以内标物苝-D12进行定量的5环和6环PAHs化合物无法定量或回收率范围波动较大。由于柱层析净化是根据物质在填料上的吸附力不同而进行分离，中性氧化铝和弗罗里硅土均为强极性吸附相，对具有一定极性的高环PAHs组分的吸附性较强，洗脱所需溶剂的用量较大，上述现象说明洗脱剂的用量不足，这些组分未能从层析柱上完全洗脱。当洗脱剂用量为40 mL和50 mL时，16种PAHs组分的回收率接近，分别为90%～103%和88%～103%。从节约时间和减少溶剂消耗的角度考虑，选用40 mL的4∶1正己烷－二氯甲烷进行洗脱。

2.4 方法的线性范围与检出限

用正己烷配制成16种PAHs质量浓度分别为0.005、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/L和含内标物质量浓度为0.100 mg/L的混合标准工作溶液，在上述优化色谱条件下进行分析。以目标物与其对应的内标物的定量离子峰面积比值为纵坐标，对应的质量浓度比为横坐标进行线性回归分析。以信噪比(S/N)为3计算检出限(LOD)。结果表明，16种PAHs在0.005～0.500 mg/L质量浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系，相关系数(r)不低于0.998 4，16种PAHs的检出限为0.03～0.28 μg/kg。方法的线性方程、相关系数、检出限见表1。

2.5 方法的回收率与精密度

选用脂肪含量高的鱼肉和蛋白质含量高的虾肉两种空白基质(未检出，残留量均小于LOD)分别进行2、20、100 μg/kg 3个加标水平的基质加标回收实验，每一水平分别做6份平行实验，结果见表2。从表2可知，2 μg/kg加标水平时，样品中16种PAHs的平均加标回收率为55%～118%;20、100 μg/kg两个加标水平下的平均加标回收率为79%～114%，相对标准偏差(RSD)均小于10%。

表2 16种PAHs的平均加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs)of 16 PAHs(n=6)

2.6 实际样品的测定

采用该方法对来自广东沿海9种海洋生物体中的16种PAHs进行检测，结果见表3。从表中可知，实际样品中有14种PAHs组分被检出，检出量为0.43～100.23 μg/kg(湿样品，下同)。9种水产品中的PAHs总量为64.22～210.57 μg/kg，其中贝类和蟹类等生物样品中的PAHs组成较为复杂，含量相对较高，这可能与PAHs各组分的理化性质、生物的生活习性以及水体中PAHs的污染来源和污染程度等因素有关。通过对比发现，本研究结果与降升平等［16］采用索氏提取法/GC－MS测定的近海海洋生物中PAHs的残留量(69.9～390.2 μg/kg)相近;但比杨家锋等［29］采用SC/T 3042－2008方法和尹怡等［23］采用分散固相萃取/GC－MS测定的部分水产品的残留量(分别为16.5～38.2 μg/kg和37.1～45.6 μg/kg)略高，这可能与水产品的来源有关。

表3 实际样品中PAHs含量的测定结果(μg/kg，湿样品)Table 3 Determination results of PAHs(μg/kg，wet sample)in samples

3 结论

建立了正己烷－二氯甲烷(2∶1)为溶剂超声辅助萃取，硫酸溶液和氧化铝－弗罗里硅土复合层析柱净化，GC－MS测定海洋生物体中16种美国EPA推荐的优先控制PAHs的分析方法。结果显示，16种PAHs在0.005～0.500 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数不低于0.998 4，检出限为0.03～0.28 μg/kg，回收率除低水平加标时萘为55%外，其余组分均高于60%，精密度和检出限均优于SC/T 3042－2008水产品中PAHs测定方法。该方法简单快速、准确可靠，取样量少，大大降低了溶剂消耗，无需特殊设备，成本较低，易于实现，可用于海洋生物体中PAHs含量的检测。

［1］Mirsadeghi S A，Zakaria M P，Yap C K，Shahbazi A.J.Environ.Sci.，2011，23(2):336 －345.

［2］Arias A H，Spetter C V，Freije R H，Marcovecchio J E.Estuar.Coast.Shelf Sci.，2009，85(1):67 －81.

［3］Mirza R，Mohammadi M，Dadolahi Sohrab A，Safahieh A，Savari A，Hajeb P.Water Air Soil Pollut.，2011，223(1):189－198.

［4］Farhadian A，Jinap S，Abas F，Sakar Z I.Food Control，2010，21(5):606 －610.

［5］Sun X M，Mei G M，Chen X C，Guo M Y.South China Fisheries Sci.(孙秀梅，梅光明，陈雪昌，郭明远.南方水产科学)，2012，8(3):48－53.

［6］Qiu Y W，Zhang G，Liu G Q，Guo L L，Li X D，Wai O.Estuar.Coast.Shelf Sci.，2009，83(1):60－66.

［7］Alomirah H，Al－ Zenki S，Al－ Hooti S，Zaghloul S，Sawaya W，Ahmed N，Kannan K.Food Control，2011，22(12):2028－2035.

［8］Binelli A，Provini A.Mar.Pollut.Bull.，2003，46(7):879 －886.

［9］Bispo J R L，Navickiene S，Dórea H S.Am.J.Anal.Chem.，2011，2(8):971 －978.

［10］Oluseyi T，Olayinka K，Alo B，Smith R M.Afr.J.Environ.Sci.Technol.，2011，5(7):482 －493.

［11］Banjoo D R，Nelson P K.J.Chromatogr.A，2005，1066(1/2):9－18.

［12］Li Z，Pittman E N，Trinidad D A，Romanoff L C，Mulholland J，Sj din A.Anal.Bioanal.Chem.，2010，396(3):1321－1330.

［13］An T，Qiao M，Li G，Sun H，Zeng X，Fu J.J.Environ.Monit.，2011，13(5):1457 －1463.

［14］Cheung K C，Leung H M，Kong K Y，Wong M H.Chemosphere，2007，66(3):460－468.

［15］Vives I，Grimalt J O，Fernández P，Rosseland B.Sci.Total Environ.，2004，324(1/3):67 －77.

［16］Jiang S P，Ma R X，Liu W L，Wang X K.J.Tianjin Univ.Sci.Technol.(降升平，马若欣，刘文岭，王学魁.天津科技大学学报)，2010，25(4):25－28.

［17］Pena T，Pensado L，Casais C，Mejuto C，Phan－Tan－Luu R，Cela R.J.Chromatogr.A，2006，1121(2):163－169.

［18］Lund M，Duedahl－Olesen L，Christensen J H.Talanta，2009，79(1):10－15.

［19］Wang G，Lee A S，Lewis M，Kamath B，Archer R K.J.Agric.Food Chem.，1999，47(3):1062－1066.

［20］Ali M Y，Cole R B.Anal.Chem.，1998，70(15):3242－3248.

［21］Pensado L，Casais M C，Mejuto M C，Cela R.J.Chromatogr.A，2005，1077(2):103－109.

［22］Fernández － González V，Concha － Gra a E，Muniategui－ Lorenzo S，López － Mahía P，Fernández － Fernández E，Prada－ Rodríguez D.J.Sep.Sci.，2010，33(23/24):3741 －3750.

［23］Yin Y，Zheng G M，Zhu X P，Ma L S，Wu S H，Pan D B，Dai X X，Xie W P.J.Instrum.Anal.(尹怡，郑光明，朱新平，马丽莎，吴仕辉，潘德博，戴晓欣，谢文平.分析测试学报)，2011，30(10):1107－1112.

［24］Navarro P，Etxebarria N，Arana G.Anal.Chim.Acta，2009，648(2):178－182.

［25］Pino V，Ayala J H，Afonso A M，González V.Talanta，2001，54(1):15－23.

［26］Rodríguez－Sanmartín P，Moreda － Pi eiro A，Bermejo － Barrera A，Bermejo － Barrera P.Talanta，2005，66(3):683－690.

［27］Martinez E，Gros M，Lacorte S，Barceló D.J.Chromatogr.A，2004，1047(2):181 －188.

［28］Ramos J J，Rial－Otero R，Ramos L，Capelo J L.J.Chromatogr.A，2008，1212(1/2):145 －149.

［29］Yang J F，Zhong H Y，Duan Q Y，Zheng D，Chai L Y.Chin.J.Health Lab.Technol.(杨家锋，钟惠英，段青源，郑丹，柴丽月.中国卫生检验杂志)，2009，19(10):2291－2295.