南阳黑猪与栾川黑猪的种群遗传关系研究

江 燕，钟晓琳，王明民，李红军，翟 磊，高腾云

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

河南省南阳黑猪又称宛西八眉猪，其体型中等，头较短，额部有菱形皱纹，最上面两条皱纹形似八字，故名“八眉”；主产区位于伏牛山脉南麓丘陵地区、缓坡地带和山前平原，为河南省地方优良种质资源品种之一。栾川黑猪产于豫西伏牛山栾川县，头形稍长，额部有皱纹，嘴长短中等，耳大稍前倾斜，下垂等特点。伏牛山区是一个典型的生态交错带[1]，这种生态环境的差异致使南阳黑猪与栾川黑猪在外部形态上存在显著差异；因而，正确认识两者之间的遗传关系并加以合理保护利用已成为当务之急。

由于微卫星具有高变异性、高突变率、数量大、共显性遗传及在基因组中广泛分布等特点[2]，因而在群体内、间分析遗传广为使用。国内外关于猪微卫星研究有不少报道[3-11]，但较少涉及对黑猪种群遗传关系分析，而南阳与栾川黑猪间遗传关系分子研究未见报道。鉴于此，本研究利用10个微卫星标记对南阳和栾川黑猪群体遗传关系进行分析，为两种黑猪品种鉴定的系统研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试猪样本 南阳黑猪46头，均采自南阳黑猪主产区。其中30头采自南召县普尼尔农业开发有限公司，10头采自内乡县南阳黑猪保种场，6头采自西峡县詹铁军养殖场。栾川黑猪30头采自洛阳栾川县亨利养殖场。随机采样前腔静脉采血，每头约5 mL，肝素钠抗凝；血样用冰块冷藏运回实验室，-20 ℃冷冻保存。

1.1.2 试剂与仪器 试剂：Go Taq Green Master Mix/ M7122(美国Promega公司)，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N',N',N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris(Sigma公司)，PBR322 DNA/MspI(郑州宝赛)。仪器：9700PCR扩增仪(ABI)，T-PCR仪，Labwork凝胶成像分析系统(Alpha innotech)，DYY-lOC型水平电泳槽(北京)，1-14型低温高速离心机(sigma)。

1.1.3 微卫星引物 这些引物的选择是从已发表的文献上获取的。10对微卫星引物均由上海生物工程技术公司合成，10对微卫星引物信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用常规酚-氯仿抽提法进行提取，配合使用全血基因组DNA提取试剂盒，检测合格后-20 ℃保存备用。

表1 10对微卫星引物的的信息Table 1 Information of ten microsatellite primers

1.2.2 PCR反应条件 反应体系10 μL，其中模板DNA1μL(50～100 ng)，Go Taq PCR Master Mix,2×为5.0 μL，上游引物和下游引物均为1 μL，Nucleas-Free Water 2 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，30 cycles(94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 扩增产物的检测及电泳分型 取2.0 μL PCR扩增产物，加6倍稀释的上样缓冲液1 μL混匀，用2%琼脂糖凝胶(GoodView染色)，并以Marker作对照，在5～8 v/cm电压下电泳1 h，在凝胶成像系统中对照Marker观察是否有所需条带，对无带和不在所需范围的，重新扩增。有条带的进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其片段大小。

1.3 统计分析

以分子量标记物(pBR322/MspⅠ)为标准，利用BandScan4.50分析软件读取各微卫星位点的基因型和片断大小，并用Cervus2.0软件分析各位点的等位基因频率、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、观察等位基因数(Na)和多态信息含量(PIC)。用Popgen32计算有效等位基因数(Ne)及Nei's遗传距离和相似度。采用SPASS17.0软件包进行t检验，试验数据以平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 部分微卫星位点聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

微卫星遵循孟德尔定律，呈共显性遗传。如果一个二倍体相对位点微卫星核心重复数相同，则这个位点为纯合基因型，反应在凝胶电泳片上是一条带，即为纯合子。若核心重复数不同，可能由碱基插入或缺失等原因，因而为杂合型，即为两条带，若无条带出现则表明为无效等位基因。图1为其中两个位点在黑猪群体中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图1 2个微卫星位点聚丙烯酰胺凝胶电泳 Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis of two loci

注：上、下图分别表示SWR308位点和SW787位点在不同黑猪个体间的扩增图谱；其中，1-17：表示黑猪不同个体；M代表pBR322/MspⅠDNA Marker。

Note： The above two figures represent the PCR of different black pigs on the loci of SWR308 and SW787, in which 1-17 represent the different individuals of black pigs; M stands for pBR322/MspⅠDNA Marker.

2.2 等位基因及其频率

南阳黑猪46个个体在10个微卫星位点上共检测116个等位基因，平均每个位点11.6个等位基因；在栾川黑猪30个个体共检测88个等位基因，平均每个位点8.8个。南阳黑猪群体中，SW781位点上检测到14个等位基因，为数目最多的，范围在134～244 bp；栾川黑猪群体的S0090检测基因数最多，达12个，变化范围为230～338 bp；可见两黑猪群体等位基因间存在较大差异(见表2)。

表2 两黑猪群体10个微卫星位点等位基因分析Table 2 The allele analysis of two black pig populations at 10 microsatellite loci

2.3 群体内遗传变异分析

由表3可知，两黑猪群体10个微卫星位点均呈高度多态性(PIC>0.5)，范围分别为0.834～0.904和0.753～0.896。其中，南阳黑猪群体中除S0090位点上多态性信息含量低于栾川黑猪群体外，其余均高于后者。观察杂合度在两群体间并无太大差异，多为1.000。10个位点中，两黑猪群体的期望杂合度普遍低于观察杂合度，南阳黑猪S0026位点的期望杂合度最低(0.861)，栾川群体中SW951位点为最低(0.796)。10个微卫星位点在两黑猪群体中均得到了较多的等位基因数，其中，南阳黑猪的SW781为最多，达到14个，而栾川黑猪群体中S0090位点高达12个。就有效等位基因数来说，南阳黑猪群体的多数位点高于栾川黑猪群体，二者变动幅度均较大，分别为6.73～11.20和4.42～10.47。

将两黑猪群体的多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)、观察等位基因数(Na)和期望杂合度(He)分别进行t检验分析，并输出P值，结果见表4。由表4可知，黑猪在10个位点的遗传变异结果。

表3 两黑猪群体在10个位点的遗传变异结果Table 3 The genetic variation of two black pig populations at 10 microsatellite loci

表4 黑猪在10个位点的遗传变异结果分析Table 4 The genetic variation analysis of black pig populations at 10 microsatellite loci

注：表中同行数据肩标大写字母不同者表示差异极显著(P<0.01)。

Note： Values with different capital letter superscripts in the same row show extreme difference (P<0.01).

2.4 群体间遗传相似性指数和遗传距离

遗传相似系数是衡量群体间遗传变异程度的可靠参数。亲缘关系越近，则遗传变异性越低，相似系数越大[12]。本研究依据10个微卫星位点的等位基因频率，运用Popgene32软件计算了两黑猪群体间的遗传相似系数和Nei氏遗传距离。结果显示，南阳黑猪和栾川黑猪群体间遗传相似系数为0.7317，遗传距离为0.3124，两群体间存在显著遗传分化。

3 讨 论

3.1 黑猪群体内遗传变异分析

等位基因是估计和比较遗传多样性及计算遗传距离的最基本数据，也是衡量微卫星座位多态性的一个重要参数。Baker等[13]提出每个微卫星位点至少应该有4个等位基因才能较好的用于遗传多样性分析。本研究中两黑猪群体的10个微卫星位点中，等位基因数均在4个以上。等位基因值越大表明微卫星位点的基因多态性越好，因此本试验所选的10个微卫星位点均为高度多态位点，可用于两黑猪群体的遗传变异分析。在同一个微卫星位点上，等位基因数目和频率的差异能反映出家畜品种内和品种间的差异，并可借此区分品种的类型；而基因频率本身也可以反应出群体之间的遗传相似度。由两黑猪群体各位点间等位基因的显著性差异可以看出，两群体间的遗传结构差异很大，且遗传相似度较低。一些等位基因在南阳黑猪某一位点中频率非常高，但在栾川黑猪群体同一位点中频率较低或者没有分布，显然，这与两黑猪群体的育种历史及所处生态条件有关。

多态信息含量(PIC)是衡量基因变异程度高低，反映遗传信息和基因丰度的一个指标。Botstein等[14]提出了衡量基因变异程度高低的指标，当PIC>0.5时，该位点为高度多态性位点；当0．25

群体的杂合度(H)又称为基因多样度，反映群体在多个基因位点上的变异，因而是度量群体遗传变异的一个最适参数。[15]。就同一种标记来说，群体平均杂合度的高低反应了群体的遗传一致性程度，群体杂合度越低，则群体的遗传一致性越高，而群体的遗传变异就越少，遗传多样性就越低。本研究中各位点杂合度均大于0.7，因而能很好的反应两黑猪群体的遗传多样性。两黑猪群体的平均观察杂合度均高于平均期望杂合度，且差值较大，这表明两群体处于不平衡状态，或其群体内都存在一定程度的近交。两群体的平均期望杂合度之间呈极显著性差异，这种遗传差异很可能与两群体所处的生态环境以及人为重视程度等方面密切相关。

有效等位基因数(Ne)也是反映群体遗传变异程度的重要指标，Hines等[16]指出等位基因在群体中的分布越均匀，则有效等位基因数就会越接近所检测到的观察等位基因数(Na)。而本研究中，两黑猪群体的有效等位基因数均是只有个别与观察等位基因数相近，大部分还是有差异的，由此可知，在这些基因座上，相应群体的等位基因分布并不均匀，造成这种不均匀的原因可能是基因的流动、自然环境的差异或者基因突变。南阳黑猪群体的平均有效等位基因数和平均观察等位基因数在多数位点上均高于栾川黑猪，这一差异可能是由于栾川黑猪进行人为选育或改良时，基于一些性状需求的选择导致了某些位点上等位基因分布不均匀，从而失去了一些等位基因。但两黑猪群体的平均有效等位基因数均很高，这说明在发生选择、突变或遗传漂变时，群体仍能有保持其等位基因的较强能力，而这也正是两黑猪群体得以发展、延续的遗传基础。

3.2 黑猪群体间遗传变异及地理分化

种群间遗传变异通常是以等位基因频率为基础的遗传距离来表示的，通过遗传距离和遗传相似性分析可以估测种群间的进化关系。Thorp[17]通过研究发现：不同物种间遗传距离Ds=0.2～0.5，同科属群体间Ds=0.5～0.9，同种群体间Ds=0.03～0.2；同种群体间遗传相似系数I=0.80～0.97。本研究中，南阳黑猪和栾川黑猪群体间遗传相似系数为0.7317，群体间遗传距离为0.3124，表明两黑猪群体间存在显著的遗传分化，因此推断二者可能属于不同的品种。

4 结 论

南阳黑猪与栾川黑猪两群体均具有较高的遗传变异,遗传多样性丰富，但栾川黑猪群体的遗传多样性略低于南阳黑猪的。

南阳黑猪与栾川黑猪在遗传结构上存在显著差异，且试验结果显示两黑猪群体间遗传相似度较低，遗传距离较远，两群体间显然产生了一定的遗传分化，因而可能属于不同的黑猪品种。

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