当归补血汤中黄芪的鉴别及黄芪甲苷的含量测定

张凤瑞,周 贤,刘 炎,翁丽丽,王淑敏＊,韩雪华

(1.长春中医药大学,吉林 长春 130117;2.延边大学,吉林延吉133000)

当归补血汤系中医经典名方,始载于李东垣的《内外伤辨惑论》,按黄芪∶当归(5∶1)组成,具补气生血等功效,多用于治劳倦内伤,气血虚,阳浮于外之虚热证。现代医学研究发现其具有促进造血、调节免疫功能、保护心脑血管等作用。本文以黄芪及其所含的黄芪甲苷成分为定性和定量指标进行薄层鉴别和含量测定,建立本品的质量控制标准。

1 仪器与试药

Waters 600液相色谱分离系统,Agilent 1100自动进样器,Alltech ELSD-2000蒸发光散射检测器。黄芪药材为膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.当归药材为当归Angelica sinensis(Oliv.)Diel.购于长春市仙草药材有限公司;乙腈为美国Fischer公司生产,色谱醇;其它试剂为分析纯;Milli-Q超纯水。黄芪甲苷对照品(批号0781-200210,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 当归补血汤供试品制备 取当归饮片10 g,黄芪饮片50 g合煎,分别加入8、6倍水,煎煮2次,每次1 h,合并煎液,滤过,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,加蒸馏水20 mL溶解,用水饱和正丁醇萃取 4次,每次40 mL,合并正丁醇液,蒸干,用甲醇定容到5 mL。用0.45 μ mol滤膜滤过,取续滤液即为供试品溶液。

2.2 黄芪对照药材供试品制备 取黄芪对照药材50 g,分别加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,滤过,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制备黄芪对照药材供试品溶液。

2.3 黄芪阴性对照供试品制备 取当归对照药材50 g,分别加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,滤过,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制备阴性对照药材供试品溶液。

2.4 黄芪甲苷对照品制备 精密称取黄芪甲苷标准品,加甲醇配成1.01 mg/mL的溶液,即得。

2.5 色谱条件 色谱柱:Diamonsil ODS-C18(5 μ,250 mm×4.6 mm)分析柱;流动相:乙腈-水(32∶68);流速:0.6 mL/min;柱温:35℃;载气流速:

2.7 mL/min;ELSD检测器漂移管温度:100℃;进样量20 μ L 。

2.6 黄芪薄层色谱鉴别 取当归补血汤浸膏1 g,加甲醇20 mL,加热回流1 h,滤过,滤液加于中性氧化铝柱(100～120目,5g,内径为10～15mm)上,用40%甲醇100mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加水30mL使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取 2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤 2次,每次20 mL,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。另取当归对照药材浸膏1 g,同法制成对照药材溶液。另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液和甲醇空白对照溶液各2 μ L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。日光下检视,供试品、对照药材、黄芪甲苷在相同的位置具有相同的斑点。见图1。

图1 黄芪薄层色谱鉴别

2.7 黄芪甲苷含量测定[1-3]

2.7.1 方法学考察

2.7.1.1 线性关系考察 取黄芪甲苷对照品溶液(1.01 mg/mL),分 别进 样 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μ L,记录峰面积 ,以黄芪甲苷进样量(μ g)的常用对数为横坐标,峰面积的常用对数为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为:lgY=4 816 28lgX+317 832,r=0.999 7。结果表明,黄芪甲苷在1.01～20.2 μ g范围内线性关系良好。

2.7.1.2 精密度试验 取同一对照品溶液,进样10 μ L,重复进样 5次,测定峰面积积分值分别为5 044 367,5 001 365,5 033 698,5 019 963,5 009 430,RSD=0.35%,精密度较好。

2.7.1.3 稳定性考察 取同一供试品溶液,定时(1,2,4,8,12 h)进行测定,进样各 20 μ L,测定峰面积积分值分别为,5 054 367,4 892 365,4 903 698,5 049 963,5 009 430,RSD=1.6%,稳定性较好。

2.7.1.4 重复性试验 精密称定样品3份,按照2.1项下方法制备样品溶液,计算含量测定结果分别为1.512,1.451 2,1.389 8,1.447 7,1.448 5 mg/g,RSD=2.98%,重复性良好。

2.7.1.5 回收率试验 精密称定已知黄芪甲苷含量为1.448 5 mg/g的样品3份,每份各 1.0 g,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(1.01 mg/mL)1 mL,按照“2.1”项下方法制备样品溶液,计算含量测定结果分别为2.437 3,2.371 6,2.431 2,2.472 4,2.389 2 mg/g,平均回收率为95.04%,RSD=1.66%。

2.7.2 样品测定 取3批当归补血汤药材,按“2.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.5”项下色谱条件进样测定,根据黄芪甲苷的线性回归方程,计算黄芪甲苷含量,结果当归补血汤分别为1.448 5,1.443 6,1.451 2 mg/g,均值为1.447 8 mg/g。

3 小结

采用薄层色谱鉴别黄芪专属性好,高效液相色谱检测黄芪甲苷在1.01～20.2 μ g范围内呈良好的线性关系,平均加样回收率为95.04%,RSD=0.61%。所建立方法简便、准确,快速、灵敏度高、重现性好,可用于当归补血汤的质量控制。

[1]王宝,苏健,鲁静.黄芪甲甙的检测在中药质控中的应用[J].中国中药杂志,1996,21(3):161.

[2]俞家华,曹正中,张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定[J].中药通报,1986,11(9):38.

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