靶向NAC-1基因的siRNA对卵巢癌HO8910细胞生长及其Wnt/β-catenin信号途径的影响

桂 玲，王 静，祝爱珍，刘成成，刘革修*

NAC-1(nucleus accumbens-1，Nac1 or NAC-1)是一干细胞多能性因子，属于BTB/POZ转录因子家族成员，与一些核蛋白相互作用，调节细胞生物学活性，参与胚胎干细胞的自我更新和多能性分化。研究显示卵巢癌细胞表达NAC-1与其紫杉醇耐药相关［1－2］。靶向NAC-1基因的 siRNA 能抑制卵巢癌HO8910细胞生长［3］。但是，NAC-1调节卵巢癌细胞生长的机制还不清楚。大量研究显示，Wnt/β-catenin信号途径在胚胎发育过程中具有重要作用，而异常表达或激活则与肿瘤发生发展密切相关［4－5］。所以，本研究分析了NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞Wnt/β-catenin信号途径及其下游靶基因cyclin D1和survivin基因表达的影响，以了解NAC-1在卵巢癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人卵巢癌细胞系HO8910(中国科学院上海细胞生物研究所)，由暨南大学生命科学技术学院生殖研究室保存;RPMI-1640培养液(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程科技有限公司);脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);Trizol、反转录试剂盒和SYBR GreenⅠMix试剂盒(Tiangen公司)、MTT试剂盒、蛋白裂解液和电化学发光(electrochemilum-inescence，ECL)试剂盒(碧云天生物技术有限公司);以NAC-1基因为靶标的特异性siRNA和阴性对照siRNA。

1.2 靶向NAC-1基因寡核苷酸的设计

采用桂玲等［3］前期研究的NAC-1基因特异性siRNA 序 列:5'-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3'，阴性对照序列为 5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'，均由广州市锐博生物科技有限公司合成及纯化。

1.3 细胞培养和转染

将人卵巢癌细胞系HO8910细胞以1×106个/孔接种于6孔板，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液培养于CO2体积分数为5%的37℃培养箱中。当细胞生长至70%汇合时，参考试剂盒说明书，用脂质体分别转染各种siRNA(50 nmol/L)。实验分组:空白对照(control)组、阴性 siRNA(negative siRNA)组和NAC-1 siRNAs组。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性

［3］。

1.5 克隆形成实验检测干细胞特性

见参考文献［3］。

1.6 FCM法检测细胞周期

见参考文献［3］。

1.7 实时荧光定量PCR法检测mRNA表达

siRNA转染48 h后收集细胞，提取总RNA、并用紫外分光光度计定量，反转录合成cDNA。以cDNA为模板、NAC-1基因特异性引物进行实时荧光定量PCR分析，根据2－△△Ct方法分析目的基因的mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primers in real time PCR

1.8 Western印迹法检测

收集细胞提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白50μg上样，进行12%聚丙烯酰胺凝胶，120 V恒压电泳1 h，200 mA恒流转膜1 h。然后，用含5%脱脂奶粉的TBST对膜封闭30 min，加入鼠抗人 NAC-1(1∶200)、β-catenin 抗体(santa Cruz)、cyclin D1抗体、survivin抗体、p-LRP6(Ser1490)抗体(cell signaling)或兔抗人GAPDH抗体于4℃孵育过夜(sigma，1∶4 000)，次日加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标志的相应二抗IgG(稀释比例为1∶3 000)于室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL发光显色，采集图像，采用Gelpro4.0软件对目的蛋白进行定量分析。以GAPDH作为内参对照(n=3)。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞生长的影响

NAC-1基因特异的siRNA不仅显著抑制卵巢癌HO8910细胞NAC-1基因表达，转染48 h后，NAC-1 mRNA和蛋白表达水平较空白对照组分别下降83%和87%(图1)，而且明显抑制HO8910细胞增殖和集落(图2，3)。

图1 NAC-1基因特异性siRNA对卵巢癌HO8910细胞中NAC-1基因表达的影响Fig 1 Effects of NAC-1 siRNA on the expressions of of NAC-1 mRNA and protein in ovarian cancer HO8910 cells，n=3)

2.2 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞周期分布的影响

NAC-1基因沉默后G1期细胞比例显著增高，与空白对照组及阴性siRNA组两者细胞周期分布相比较有显著差异(p＜0.05)(图4，表2)。

2.3 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞Wnt/β-catenin信号途径信号分子基因的影响

图4 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞Wnt/β-catenin信号途径LRP6、β-catenin、cyclin D1和survivin基因表达的影响Fig 4 Effects of NAC-1 siRNA on expression of LRP6，β-catenin，cyclin D1，and survivin genes in ovarian cancer HO8910 cells(n=3)

表2 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞周期分布的影响Table 2 Effect of NAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells，%，n=3)

表2 NAC-1基因沉默对卵巢癌HO8910细胞周期分布的影响Table 2 Effect of NAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells，%，n=3)

*P ＜0.05 compared with the control group．

group G0/G1 S G2/M control 43.54±5.72 24.91±4.48 31.55±4.76 negative siRNA 42.91±5.76 25.43±4.61 31.66±4.73 NAC-1 siRNA 54.93±6.49*13.84±3.15 31.23±4.74

NAC-1基因沉默显著抑制卵巢癌HO8910细胞Wnt/β-catenin信号途径活性:NAC-1 siRNA转染48 h后，β-catenin、cyclin D1和survivin蛋白水平显著低于空白对照组(p＜0.01)(图4B);cyclin D1、survivin基因mRNA表达水平则分别较空白对照组下降63%和67%(p＜0.01)(图4A)。

3 讨论

经典的Wnt信号传导途径主要成分包括细胞外因子(Wingless，Wnt)、跨膜受体(frizzled，Frz)、辅助受体(LRP-5和LRP-6)、β-catenin等一系列蛋白质，靶基因包括C-MYC、cyclin D1和survivin基因。Wnt/β-catenin信号途径活性主要表现在 p-LRP6和βcatenin蛋白水平的变化，大量游离的β-catenin在胞质中聚集并进入胞核内和T细胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)结合，并调节靶基因转录。Wnt/β-catenin信号途径在细胞增殖中起重要作用，过度激活时会影响到细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生。靶基因survivin基因在卵巢癌组织中高表达，对卵巢癌发生发展具有重要作用［6－9］。细胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)与特定的CDK(周期素依赖性激酶)结合构成复合体，可在G1/S交界处将信号传导途径与细胞周期调控联系起来，完成各个时期的转换。其过度表达可缩短G1期，并减少对生长因子的依赖性，促使细胞越过G0/S和(或)G1/S过渡点而持续分裂增殖，促进肿瘤的生长。本研究则显示，NAC-1基因沉默不仅抑制卵巢癌HO8910细胞生长、阻滞卵巢癌HO8910细胞周期从G1期向S期转化，而且Wnt/β-catenin途径活性下降，即β-catenin蛋白以及下游靶基因cyclin D1和survivin基因表达水平降低。这表明，NAC-1通过增强Wnt/β-catenin途径活性，参与调节卵巢癌细胞的生长和存活。

NAC-1(nucleus accumbens-1)是一个新的干细胞多能性因子，属于 BTB/POZ转录因子家族成员［10］，能调节其他多能分化因子的表达，如Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和 Sall4 等，参与胚胎干细胞的自我更新和多能性分化，对胚胎干细胞的多能分化是至关重要的。研究发现，卵巢癌化疗后复发的患者体内NAC-1表达水平明显高于初发未治者，并证明其与卵巢癌复发有关［11－12］。研究显示［3］，特异性NAC-1 siRNA可沉默卵巢癌细胞中的目的基因NAC-1、并明显抑制其生长，且细胞周期被阻滞于G1期。本研究结果则在这些基础上分析了信号机制。但NAC-1增强Wnt/β-catenin途径活性的机制有待进一步研究。

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