胡炜东,邹 寅
(内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头014109)
南瓜籽又称白瓜籽、金瓜籽,是葫芦科植物南瓜的成熟种子,含有丰富的必需脂肪酸、氨基酸、植物甾醇、蛋白质、维生素和多糖等,营养非常丰富,在我国种植范围广、种类多,资源丰富,极具开发价值。南瓜籽同时也是具有广阔开发应用前景的营养保健油源。南瓜籽中油脂含量较高,可占干质量的35%~50%,其中亚油酸38.60%、油酸28.63%、棕榈酸16.55%、硬脂酸8.42%。南瓜籽油不仅能明显降低血清胆固醇和甘油三酯,而且还能驱除寄生虫和防止前列腺疾病[1-2]。目前,南瓜籽油的提取方法有索氏提取法[3]、超临界流体萃取法[4]、压榨法[5]、酶法[6]和超声波法[7]。由于酶的反应条件温和,既可以保持油的有效成分,获得优质的南瓜籽油,又可以保持蛋白质和其他成分的性质,使其进一步被加工利用[8]。本研究采用酶法提取南瓜籽油,以用酶量、反应时间、反应温度与提取率为指标,在单因素实验的基础上,利用Box-Benhnken的中心组合设计原理及响应面分析法,确定最佳提油工艺参数。为南瓜籽油的提取提供新的有效途径,为生产实践进一步服务。
南瓜籽 内蒙古河套地区籽用裸壳南瓜籽(水分含量5.7%,蛋白35.64%,纤维含量14.32%,可溶性还原糖35.63mg/100g);纤维素酶(活力为35000U/g)上海锐谷生物有限公司;所用试剂均为分析纯 内蒙鸿日公司。
TCL-16GB高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;LK-600B万能粉碎机 上海新诺仪器设备有限公司;索氏提取器 上海鲁硕实业有限公司;RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化厂;JA2003电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司。
1.2.1 南瓜籽油含量的测定[9]采用索氏提取法(GB/T5009.6-2003)。
1.2.2 纤维素酶辅助提取南瓜籽油的工艺[10-11]
南瓜籽→预处理→粉碎→称量→酶解→有机溶剂萃取→离心分离→真空旋转蒸发→粗油→恒重→称量
1.2.3 纤维素酶辅助提取南瓜籽油实验步骤 将南瓜籽从瓜囊中摘出,洗净后,烘干至恒重,粉碎,过60目筛,准确称取50g,按固液比1∶4加入柠檬酸缓冲液,调节pH4.8,水浴5min,加入纤维素酶,搅拌,酶解后加入石油醚提取30min,作用完毕以8000r/min离心30min,对油相进行旋转蒸发,所得粗油干燥称重,计算提取率,4℃保存。
1.2.4 单因素实验 通过单因素实验,确定p H在4.6~5.0范围内南瓜籽油的提取率达到最大,而在此范围内pH对南瓜籽油提取率的影响差异非常小,因此选用纤维素酶的最适pH4.8为宜;当固液比(物料∶柠檬酸缓冲液)达1∶4时,增加固液比对南瓜籽油的提取率增加缓慢,从工艺角度考虑,按固液比1∶4加入柠檬酸缓冲液最佳。进一步选取对酶法提油工艺有显著影响的三个因素,即用酶量、酶解时间和酶解温度,按照上述方法对南瓜籽油进行提取实验,并计算提取率。
1.2.5 纤维素酶辅助提取南瓜籽油实验设计 在单因素实验结果的基础上,利用Box-Benhnken的中心组合设计原理,三个主要因素用酶量(mg/g)、酶解时间(h)、酶解温度(℃),分别用 X1、X2、X3来表示,每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、+1进行编码,实验因素与水平设计见表1。
表1 响应面分析实验因素水平与编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments
1.2.6 南瓜籽油提油率计算
式中:W提取油为提取出南瓜籽油的质量;W原料为南瓜籽粉末的质量;α为南瓜籽含油率。
重复3次索氏提取实验,测得南瓜籽油含量为43.05%。南瓜籽含油量显著大于玉米胚芽油和大豆油[12]。
2.2.1 用酶量对提取效果的影响 固定反应温度45℃,反应时间 2h,设定用酶量 5、10、15、20、25mg/g,考察用酶量对南瓜籽油得率的影响。得到用酶量与南瓜籽油提取率的关系如图1所示。
图1 用酶量对南瓜籽油提取率的影响Fig.1 Effect of cellulose concentration on pumpkin seed oil extraction rate
由图1可知,随着酶浓度的增加,南瓜籽油的提取率也在逐渐增大,当加酶量大于15mg/g时,油提取率趋于稳定,考虑到酶的成本及油的提取效果,宜将酶的添加量确定为15mg/g。
2.2.2 反应时间对提取效果的影响 固定用酶量为10mg/g,反应温度45℃,设定酶解时间 1、1.5、2、2.5、3、3.5h,考察时间对南瓜籽油得率的影响。得到酶解时间与南瓜籽油提取率的关系如图2所示。
图2 酶解时间对南瓜籽油提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on pumpkin seed oil extraction rate
由图2可知,随着酶解时间的延长,南瓜籽油提取率也随之增加,当酶解时间超过2.5h后提取率略有下降,考虑到实际生产需要,酶解时间以2.5h为宜。
2.2.3 反应温度对提取效果的影响 固定用酶量为10mg/g,反应时间 2h,设定酶解温度 35、40、45、50、55、60℃,考察温度对南瓜籽油得率的影响。得到酶解温度与南瓜籽油提取率的关系如图3所示。
图3 酶解温度对南瓜籽油提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on pumpkin seed oil extraction rate
由图3可知,酶解温度达45℃时南瓜籽油提取率最高为80.54%,但在40~50℃范围内提取率差异不大,在实际生产中,可根据实际生产条件选择45℃左右温度为宜。
2.3.1 实验结果 Box-Benhnken三因素三水平实验所得南瓜籽油提取率见表2,模型共设15个实验,其中1~12号实验为析因实验,13~15号为中心实验。析因实验构成三维定点,中心实验为区域的中心,重复三次中心实验以估计误差。
2.3.2 模型建立 利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行多元拟合,得到用酶量(X1)、酶解时间(X2)、酶解温度(X3)二次多项回归方程:Y=88.96667+2.48000X1+0.88375X2+2.19375X3+1.80500X1X2+ 0.05500X1X3+ 0.92750X2X3-4.30708X12-3.35458X22-3.87958X32
2.3.3 方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行多元回归分析,结果见表3,方差分析表明,以南瓜籽油提取率为响应值建立的回归模型是显著的,而误差项不显著,说明回归方程与实际情况吻合度较好,确定系数 R2=98.91%,R2Adj=96.94%。因此,可用该模型回归方程代替真实实验点对实验结果进行分析。而且模型中一次项、二次项的影响是显著的,表明各因素对油提取率的影响是非线性关系。影响南瓜籽提取率的因素按主次顺序排列:用酶量(X1)>酶解温度(X3)>酶解时间(X2)。
2.3.4 响应面分析 根据回归分析结果做出相应的响应面分析图,由图4~图6可以看出存在极值的地方应该在等值线图的圆心,用酶量(X1)对南瓜籽油提取率影响最大,表现为曲线较陡;酶解温度(X3)、酶解时间(X2)次之,表现为曲线较平滑,随其数值的变化,响应值变化较小,从图5可以看出,响应面曲线较陡,说明用酶量(X1)和酶解温度(X3)对南瓜籽油提取率的影响较明显,这与方差分析的结果相一致。由图4~图6中等高线的形状可以反映出交互效应的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形表示相反,图4等高线可以看出,用酶量(X1)与酶解时间(X2)交互作用对南瓜籽油的提取率影响显著,表现为等高线呈椭圆形,酶解时间(X2)和酶解温度(X3)交互作用次之,由图5可知,用酶量(X1)与酶解温度(X3)之间交互作用最小,表现为响应面曲线间差异小,等高线最接近于圆形。
表3 回归分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance
图4 用酶量与酶解时间对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.4 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis time on the extraction rate of oil
为了确定各因素的最优值,利用软件分析得X1、X2、X3的最大代码值 0.346、0.269 和 0.317,换算得出实际值为用酶量(X1)16.73mg/g,酶解时间(X2)为2.6345h,酶解温度(X3)为46.585℃,理论提取率为89.86%。
2.3.5 回归模型的验证实验 为检验响应面分析所得结果的可靠性,采用上述优化条件进行提取南瓜籽油实验,考虑到实际操作,将提取条件修正为用酶量17mg/g,酶解时间为2.64h,酶解温度为47℃,在此条件下提取3次,南瓜籽油平均提取率89.12%,实验值与理论值的相对误差为0.82%。由此可见该模型很好的反映了酶法提取南瓜籽油的条件,证明利用响应面法确立酶法提取南瓜籽油的工艺参数是可行的。
图5 用酶量与酶解温度对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.5 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil
图6 酶解时间与酶解温度对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface of hydrolysis time and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil
利用辅助酶法提取南瓜籽油,具有高效、温和、经济等特点,同时采用Box-Benhnken中心组合设计原理及响应面分析法,利用Design-Expert软件进行便捷、可靠的优化组合和数据分析,得出纤维素酶提取南瓜籽油的较佳工艺:用酶量17mg/g,酶解时间为2.64h,酶解温度为47℃,南瓜籽油提取率达89.12%。与理论预期值的拟合度较好。各因素主次关系为:用酶量(X1)>酶解温度(X3)>酶解时间(X2)。
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