复合不育剂EP-1对小鼠空间记忆与焦虑行为的影响

王晓佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纤，黄银春，张洪茂

(华中师范大学生命科学学院，分子与行为生态学研究组，武汉 430079)

复合不育剂EP-1对小鼠空间记忆与焦虑行为的影响

王晓佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纤，黄银春，张洪茂*

(华中师范大学生命科学学院，分子与行为生态学研究组，武汉 430079)

EP-1是由炔雌醚和左炔诺孕酮按照1∶2的比例配制而成的一种用于鼠类不育控制的激素类复合不育剂，对鼠类的繁殖及繁殖行为等有一定影响，但对鼠类空间学习与记忆、焦虑行为等非繁殖行为的影响还没有报道。为此，用0 (对照)、1.0、2.0、3.0 mg/kg剂量的EP-1对昆明小鼠(Musmusculus)进行灌胃处理，然后用Morris水迷宫和高架十字迷宫分别测定其空间记忆、焦虑行为。结果发现灌胃后15 d，剂量为2.0 mg/kg的EP-1使小鼠空间记忆能力显著下降，但30 d后其空间记忆能力有所恢复，表明2.0 mg/kg剂量的EP-1可以在一定时间范围内降低小鼠的空间记忆能力。但不同剂量的EP-1对小鼠焦虑行为无显著影响。该结果可以为从对非繁殖行为的影响的角度研究EP-1对鼠类的作用提供一定启示。

昆明小鼠(Musmusculus)；EP-1；空间记忆；焦虑

不育控制是借助某种技术和方法使雄性或雌性不育，或阻碍胚胎着床发育，甚至阻断幼体生长发育，以降低鼠类的生育率，达到控制其种群数量和密度的目的，其本质是生育控制[1- 2]。不育控制技术因其效果持久、生态安全等特点而备受关注[1,3]。

EP-1是由炔雌醚(quinestrol)和左炔诺孕酮(levonorgestrel)按照1∶2的比例配制，用于鼠类不育控制的激素类复合不育剂，能对多种鼠类的繁殖和繁殖行为产生不同程度的抑制作用[4]。例如EP-1可以降低布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)、灰仓鼠(Cricetulusmigratorius)和子午沙鼠(Merionesmeridianus)等鼠类的产仔率、产仔窝次数、胎仔数、延长产仔时间等[4]；可以有效降低大仓鼠(Tscherskiatriton)[5- 6]、黑线毛足鼠(Phodopuscampbelli)[7]、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)[8]、长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[9]等的种群繁殖力、种群数量，产生明显的抗生育作用；此外EP-1还可以使雄性大仓鼠的繁殖器官明显萎缩，变小[6]。但也有报道认为EP-1对雌性布氏田鼠的抗生育作用不明显[10- 11]。然而，EP-1除了以生殖系统为作用靶标，直接影响鼠类与繁殖相关的生理过程和行为外，还可能影响非繁殖行为及其生理过程，例如空间记忆、焦虑等[12]，间接地影响鼠类的生存和繁殖，进而达到控制害鼠种群数量和密度的效果。空间记忆能力丧失或降低，过度焦虑等对人和鼠类的健康乃至生存具有重要影响[13- 14]。例如空间记忆能力减弱可能导致动物难以寻找食物和躲避危险而危及生存[15]；持续焦虑会引起人或动物行为异常、代谢紊乱而危及健康[16]。激素类药物会影响鼠类空间记忆和焦虑已有少量报道，例如双酚A(bisphenol A)可以降低雄性小鼠的空间学习与记忆能力，并且可以导致雄性小鼠的焦虑行为[12]；孕酮(progesterone)可以导致大鼠与小鼠在高架十字迷宫中的焦虑行为[17]。但尚无关于EP-1影响鼠类空间记忆和焦虑的报道，评估EP-1对鼠类的综合作用效果时也常常忽略了EP-1对鼠类空间记忆、焦虑等非繁殖行为的影响。

为此，以小鼠在水迷宫(MWM)中的逃逸潜伏期、目标象限滞留时间、穿越逃逸平台次数为空间记忆指标，以小鼠在高架十字迷宫(EPM)内开臂进入次数和开臂滞留时间为焦虑行为指标，分别研究了不同剂量的EP-1在不同时间段对昆明小鼠(Musmusculus)空间记忆和焦虑的影响，以探索EP-1能否对鼠类的空间记忆及焦虑产生影响，为从对非繁殖行为影响的角度研究和评估EP-1对鼠类的作用提供一定启示和参考。

1 材料与方法

1.1 实验鼠及分组

1.2 实验过程

按照1∶2的比例将炔雌醚和左炔诺孕酮溶解于花生油(鲁花牌)中，分别配制成1.0、2.0、3.0 mg/mL的EP-1溶液，并以花生油为对照。每天18:00—19:00用小鼠灌胃器(zc14000, 武汉博驰生物科技有限公司)对各组小鼠灌胃，连续给药15 d，每5 d测定一次小鼠体重。给药结束后以正常饲料饲养。

Morris水迷宫(MWM)实验:该实验分别在给药结束后15 d与30 d各进行1次，每次连续训练5d。以经典Morris准则使用MWM测定空间学习与记忆[18]。MWM(DB001, 淮北正华生物仪器有限公司)由黑色圆柱形恒温游泳水池(直径120 cm, 高40 cm)，黑色隐藏平台(直径8 cm，高21 cm)及摄像与记录系统组成，置于控温房间内，并用黑色不透光布帘罩住，以保证稳定的测试环境和避免实验鼠利用其它的空间记忆线索。实验时在水池四周做4个迷宫标记，将水池分为4个象限，隐藏平台所在的区域为目标象限，水深22 cm，水温(22±1) ℃。实验开始时，将小鼠头面对水池墙壁上的标记，由任一象限入水，并利用摄像系统记录小鼠对隐藏平台的寻找。设定找寻时间60 s，小鼠在60 s内找到隐藏平台并滞留3 s及以上，视为逃逸成功，从动物入水至逃逸成功所用时间记为逃逸潜伏期。如果小鼠60 s内未找到隐藏平台(未成功逃逸)，则由实验者将其引导至隐藏平台上适应30 s，以帮助小鼠学习，逃逸潜伏期记为60 s。每只小鼠分别在四个象限连续训练5 d。用逃逸潜伏期表示小鼠的学习能力。然后撤去平台，在任意一非目标象限放入小鼠，记录其目标象限滞留时间和穿越隐藏平台次数，以测试其空间记忆(寻找隐藏平台)能力。

高架十字迷宫(EPM)测试:该实验在水迷宫实验完成后第2天进行。EPM测试是研究啮齿类动物焦虑的经典试验方法[17]。EPM(XR-XG201, 武汉一鸿科技有限公司)“十”型平台距离地面50 cm，由两条相对开臂(50 cm长×10 cm宽)和两条相对闭合臂(50 cm长×10 cm宽×40 cm高)及中央区(10 cm×10 cm)组成，置于暗室内(80 lx)。实验开始时，将动物背对实验者面对开臂放入迷宫中央区，随后5min内用摄像机记录小鼠在迷宫里的活动情况。为了消除不同次测试间的相互影响，每次测试结束后立即清除小鼠粪便，用医用酒精(75%浓度)擦洗迷宫，并闲置30min待酒精挥发后再进行下一次测试。用ANY-MAZE软件分析动物开臂进入次数和开臂滞留时间，以此反映实验动物的焦虑状态。

1.3 数据分析

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。用Mann-Whitney U Test分别对水迷宫实验中逃逸潜伏期，目标象限滞留时间、平均穿越平台次数，以及对高架十字迷宫实验中开臂进入次数、开臂滞留时间进行各实验组与对照组之间的两两比较。

2 结果

Morris水迷宫测定结果显示，经过5 d寻找隐藏平台训练，四组小鼠的逃逸潜伏期迅速下降，到第5天时达较精准水平。给药后15 d，与对照组相比，各处理组鼠的逃逸潜伏期较对照组延长，但1.0 mg/kg组、3.0 mg/kg组无显著性差异，2.0 mg/kg组在水迷宫训练的第5天 (Z= -2.893,P= 0.004)有极显著性差异(图1)。给药后30 d，各处理组鼠的逃逸潜伏期较对照组延长，水迷宫训练的第1天 1.0 mg/kg组(Z= -2.463,P= 0.014), 2.0 mg/kg组(Z= -2.163,P= 0.031)小鼠差异显著，但第2天，第3天，第4天，第5天无显著差异(图1)。

图1 不同剂量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宫内的逃逸潜伏期Fig. 1 Escape latency of Mus musculus within Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均数±标准误; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示与对照组差异显著

给药后15 d，2.0 mg/kg组(Z= -2.911,P= 0.004)和3.0 mg/kg组(Z= -2.654,P= 0.008)小鼠在目标象限内的滞留时间较对照组显著减少；给药后30 d，处理组小鼠在目标象限内的滞留时间较对照组无显著差异(图2)。与对照组相比，给药后15 d, 2.0 mg/kg组平均穿越平台的次数显著减少(Z= -2.459,P=0.014)，1.0 mg/kg组、3.0 mg/kg组无显著差异；给药后30 d，各组平均穿越平台次数较对照组均无显著差异(图2)。

图2 不同剂量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宫内目标象限滞留时间和平均穿越平台次数Fig. 2 Retention time and frequency in crossing the hidden platform of Mus musculus in the target quadrant of Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均数±标准误; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示与对照组差异显著

高架十字迷宫测定结果显示，给药后15 d，30 d各处理组小鼠开臂滞留时间、开臂进入次数较对照组均无显著差异(Pgt; 0.05, 图3)。

在班级管理过程中，评优是对学生积极性的激发，是对学生努力成果的肯定，让学生树立自信，完善他们的人格，对学生今后的发展有着深远的意义。结果是一件事情发展到最后的成果，而过程是结果的前提，没有过程就没有一个完美的结果，不注重过程不会体会到成长的艰辛和乐趣，因此，评优推先要重视过程，认真对照过程记录，关注学生的习惯养成，让优秀者名副其实，真正拥有榜样作用；让落评者从成长过程中找出不足，通过努力，追赶先进，最终形成你追我赶，拥有正能量的班集体。

图3 不同剂量EP-1灌胃后第15天、30天小鼠在高架十字迷宫内开臂滞留时间和开臂进入次数Fig.3 Time spent in open arms and entries into open arms of Mus musculus in the elevated plus maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均数±标准误

3 讨论

结果表明EP-1处理可以在一定时间内(15 d)导致小鼠的空间学习记忆能力下降。动物表现为寻找隐藏平台的潜伏期显著延长，当平台撤去时动物在隐藏平台所在象限滞留时间和穿越隐藏平台次数明显减少。该结果与Ryu 等关于动物在应对外界压力时可能出现认知缺陷，导致空间记忆能力下降的研究结果类似[19]。但田栋等研究表明双酚A对雌性小鼠的空间记忆能力影响不显著[12]，这可能是不同激素的差异所致。经过一段时间(30 d)后，小鼠的空间学习记忆能力有所恢复，表现为随着EP-1作用时间延长，处理组与对照组小鼠之间逃逸潜伏期的差异性减小，目标象限滞留时间和隐藏平台穿越次数整体降低，处理组与对照组之间差异不明显，表明EP-1对小鼠空间学习记忆能力的影响可能具有可逆性。沈伟等也曾报道炔雌醚对雄性长爪沙鼠生殖器官和繁殖的影响具有可逆性[20]，表明EP-1对鼠类繁殖行为与非繁殖行为的影响可能在一定程度上都具有可逆性。与对照组相比，处理组小鼠寻找隐藏平台潜伏期延长、在目标象限滞留时间缩短、穿越原平台次数减少，表明EP-1处理可能在一定程度上导致小鼠的认知障碍，降低其空间学习记忆能力，进而可能影响小鼠的生存[15]。自然条件下，空间记忆能力下降或丧失会危及鼠类生存和繁殖，从而可能降低种群密度，达到控制害鼠的目的[21- 22]。例如，分散贮藏食物的鸟类和鼠类，很大程度上依靠空间记忆找回食物以度过食物短缺期，空间记忆下降或丧失，贮食动物将无法找回贮藏食物而危及生存和繁殖，导致种群数量下降[21- 22]。因此，该结果可能为从“降低空间记忆、影响生存与繁殖、降低种群密度，有效防控鼠害”的角度探索EP-1对鼠类的影响提供一些启示和思考方向。

Spielberge 等将焦虑分为特质焦虑和状态焦虑，特质焦虑是相对持久的、焦虑倾向相对稳定的、个体差异明显的焦虑；而状态焦虑则是指焦虑的暂时波动状态，是由特定的情境引起的[23]。本文实验结果表明EP-1处理对小鼠焦虑反应无显著影响，表现为EP-1处理小鼠和对照组在高架十字迷宫内开臂进入次数和开臂滞留时间无显著差异。关于激素与鼠类焦虑的关系已有少量研究结果，例如双酚A可使雄性小鼠焦虑，而使雌性小鼠的焦虑有所缓解[12]；孕酮(progesterone)可以导致大鼠与小鼠焦虑行为等[17]，但尚无EP-1影响鼠类焦虑行为的报道。 EP-1可能导致不同鼠类体重减轻，生殖器官萎缩、繁殖行为弱化、繁殖能力下降等[5- 9]。室内观察结果也表明，EP-1处理会导致小鼠食量减少、体重减轻、胚胎死亡、亲体抚育行为减弱及杀婴等(王晓佳等，未发表)。这些结果表明，EP-1会导致小鼠身体条件下降，对环境压力的反应可能增强，进而产生不同程度的焦虑反应。该种焦虑反应可能属于Spielberge 等定义的状态焦虑，会随着不同的情景条件而变化，具有短暂性和波动性[23]。测试的时间可能错过了由EP-1引起的小鼠焦虑反应时期，结果难以否定EP-1刺激小鼠及其它鼠种焦虑反应的可能性，因此这方面还需要继续研究。

结果表明EP-1在一定时间内可以导致小鼠的空间学习记忆能力下降。这可能是EP-1直接作用的结果，也可能是EP-1作用于鼠类繁殖和繁殖过程的行为表现，类似药物反应副作用。由于个体差异较大，数据的标准误差也较大，意味着测试存在较大的差异区间及不同剂量间的重叠，导致结果具有一定的不确定性。同时，测试限于给药后15 d和30 d，时间间隔有一定随意性，结果体现了两个时间点EP-1处理和对照间的差异，但难以反映整个给药过程(30 d) 的行为变化。因此，结论尚需在更精确的实验条件下加以验证。但作为新探索之一，该实验的思路和结果在探索EP-1对鼠类非繁殖行为的影响方面还是具有某些启示和借鉴意义。野外条件下，空间学习记忆能力下降会影响鼠类的生存和繁殖，导致种群下降，达到鼠害防控的目的。因此该结果也可以为从EP-1导致空间记忆能力下降进而危及生存和繁殖的角度探索EP-1对野生鼠的效用提供一定启示。

致谢:感谢华中师范大学生命科学学院廖晓梅博士为水迷宫、高架十字迷宫测试提供的帮助。

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EffectsofEP-1onspatialmemoryandanxietyinMusmusculus

WANG Xiaojia, QIN Tingting, HU Xia, HU Qian, HUANG Yinchun, ZHANG Hongmao*

MolecularandBehaviouralEcologyGroup,CollegeofLifeSciences,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China

It has been reported that the EP-1, a contraceptive compound composed of levonorgestrel and quinestrol with the ratio of 1∶2, has negative effects on the breeding and reproductive behaviors in some species of mice and rats. However, little is known that the effects of EP-1 on spatial memory and anxiety in mice. Here, the effects of treatment time (15 d and 30 d) and dose (0 mg/kg (control), 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg) of EP-1 on spatial memory and anxiety inMusmusculuswere tested using Morris water maze and elevated plus maze separately. Negative effects of 2.0 mg/kg EP-1 on spatial memory of the subjects were found in 15 days, and this ability recovered in 30 days, implying the 2.0 mg/kg EP-1 can decrease the ability of spatial memory ofM.musculuswithin a period of time. No significant effects were found in all treatments of time and dose of EP-1 on anxiety of the subjects. The results might help to evaluate the effects of EP-1 on mice in respect to non-reproductive behaviors.

anxiety; EP-1;Musmusculus; spatial memory

2012- 06- 09;

2012- 11- 19

*通讯作者Corresponding author.E-mail: hongmaozhang@gmail.com

10.5846/stxb201206090829

王晓佳，秦婷婷，胡霞，胡纤，黄银春，张洪茂.复合不育剂EP-1对小鼠空间记忆与焦虑行为的影响.生态学报,2013,33(17):5228- 5233.

Wang X J, Qin T T, Hu X, Hu Q, Huang Y C, Zhang H M.Effects of EP-1 on spatial memory and anxiety inMusmusculus.Acta Ecologica Sinica,2013,33(17):5228- 5233.