5种旋毛虫肌肉幼虫囊包玻片标本制作方法的比较

刘润芳，张小娟，王新彩，祝晓莹

旋毛形线虫简称旋毛虫(Trichinella spiralis)，其成虫寄生在宿主的十二指肠和空肠上段，幼虫寄生在同一宿主的横纹肌细胞内，引起的旋毛虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。人食入含有活幼虫囊包的肉类及其制品而感染，从病人肌肉组织中查到旋毛虫幼虫囊包是最准确的诊断方法[1]。因此寻找快速、简便、有效的旋毛虫肌肉幼虫囊包标本制作方法对旋毛虫病的诊断和人体寄生虫学实验教学具有重要意义。 本文在对酸性和碱性溶液的浓度、溶液中染色剂的含量进行调整的基础上，采用不同浓度的醋酸卡红、明矾卡红、不染色5种方法对旋毛虫肌肉幼虫囊包进行染色观察比较。结果显示，10%醋酸卡红染色法或将45%醋酸卡红原液稀释100倍对标本染色，均取得理想的染色效果。所以旋毛虫肌肉幼虫囊包永久性玻片标本的制作可采用这两种染色方法。

1 材料与方法

1.1标本来源旋毛虫阳性鼠由郑州大学医学院病原生物学教研室王忠全教授、崔晶教授惠赠。SPF小鼠购于河南省实验动物中心。将24只雌性小鼠随即分为4组，每组6只，取含有旋毛虫幼虫的小鼠肌肉压片计数，每组分别喂饲的旋毛虫幼虫数为50条/只，100条/只，150条/只、200条/只。在感染后45 d将小鼠断髓处死，取咬肌、膈肌、舌肌、腹肌、肋间肌、前腿肌、后腿肌压片，在显微镜下观察旋毛虫囊包和囊内幼虫的形态[2，3]。

1.2标本固定将显微镜下观察到的含有旋毛虫幼虫囊包的小鼠肌肉压片用棉线捆扎，置于70%酒精固定48 h。

1.3染色

1.3.110%醋酸卡红染液(方法1) 用蒸馏水将方法2的染液稀释1倍，分色时间延长至35 min。其他方法同方法3。

1.3.220%醋酸卡红染液(方法2) 配制染液时，将1 g卡红加于冰醋酸20 mL和蒸馏水80 mL中，煮沸、过滤，直接用于标本染色。分色时间延长至20 min。其他操作步骤同方法3。

1.3.345%醋酸卡红染液原液稀释100倍染色(方法3) ①染色：将5 g卡红加于冰醋酸45 mL和蒸馏水55 mL中，酒精灯加热煮沸，过滤，密封保存。使用时取1份原液加99份蒸馏水稀释，自酒精固定液内取出标本，打开玻片，用手术刀片将肌肉小心刮下，在70%酒精中洗5 min，放入稀释后的染液内染色，染色时间18～24 h。②分色：2%盐酸酒精分色2～3 min,70%酒精洗涤2次，每次2～3 min。③脱水：将肌肉标本依次放入80%、95%、95%、100%乙醇中脱水各30 min。④透明：将标本放入纯酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入纯二甲苯透明30 min。⑤封片：用镊子夹取肌肉标本置于洁净载玻片右侧约1/3处，轻压使肌肉标本平整，在肌肉标本处滴适量加拿大树胶，加盖玻片封片。

1.3.4明矾卡红染色(方法4) ①染液配制：将1.5 g卡红溶于3%钾明矾水溶液中，煮沸15 min，轻轻搅拌使卡红充分溶解，冷却、过滤，加入几滴甲醛。②染色：将保存于70%酒精的肌肉标本依次浸入60%、50%、40%、30%酒精中逐渐退至蒸馏水中，每次30 min。将旋毛虫肌肉标本浸于明矾卡红标本中过夜。③分色：将标本自染色液中取出，用蒸馏水换洗2次，每次20 min，然后用2%钾明矾水溶液分色30 min。④将肌肉标本依次放入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇中脱水各30 min。⑤透明：将标本放入环保透明剂透明，隔夜。⑥封片：用镊子夹取肌肉标本置于洁净载玻片右侧约1/3处，轻压使肌肉标本平整，在肌肉标本处滴适量加拿大树胶，加盖玻片封片。

1.3.5不染色标本的制作(方法5) 将70%酒精固定好的肌肉标本放入培养皿，加入纯酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入纯二甲苯透明30 min，加拿大树胶封片。

2 结果

2.1方法1制作的标本(图1A) 在光学显微镜下观察，标本颜色极浅，接近不染色标本，肌纤维不太明显，囊包轮廓清晰，囊内幼虫立体感强，清楚可辨。

2.2方法2制作的标本(图1B) 标本被染成深红色，囊包与肌纤维界限清晰，囊内幼虫着色较深，标本不甚透明。

2.3方法3制作的标本(图1C) 标本肌肉呈淡紫红色，囊内幼虫淡红色，囊包壁颜色较浅，囊包与肌肉组织界限分明，标本透明度较好。

2.4方法4制作的标本(图1D) 标本肌肉组织被染成淡紫色，囊包和囊内幼虫呈较深的紫色，囊包和肌纤维轮廓清晰，囊内幼虫立体感欠佳。

2.5不染色标本(图1E) 囊包界限尚可，囊内幼虫欠清晰。

A：方法1制作的标本；B：方法2制作的标本；C：方法3制作的标本；D：方法4制作的标本；E：方法5制作的标本

3 讨论

旋毛虫肌肉幼虫囊包永久性玻片标本的制作方法有多种，但标本的制作效果和溶液的种类、浓度，所采用染料的种类及其在溶液中的含量，染色过程中各个步骤时间的控制均有很大关系[4，5]。卡红是从昆虫胭脂虫中提炼出来的一种粉末状染料，可溶解于酸性或碱性溶液中。醋酸卡红适宜于小型标本的染色，渗透作用快,兼有杀死固定作用,且染色标本不易褪色[6，7]。本次采用醋酸卡红制作标本过程中，45%的醋酸卡红原液(含卡红5 g)稀释100倍、10%的醋酸卡红染液(含卡红0.5 g)制作的标本囊包轮廓清晰，囊内幼虫卷曲自然清晰、立体感强，效果较佳。只是前者稀释倍数较大，染色较淡，所以适当降低原液的稀释倍数可取得理想的染色效果。20%的醋酸卡红(含卡红1 g)染液，溶液较浓，染色过深，虽延长分色时间至40 min仍不能取得满意染色效果。明矾卡红染色力较弱，适合小型标本的染色，没有浓染之弊。在采用明矾卡红染液染色过程中，作者用烷烃化合物类环保透明剂代替二甲苯进行标本的透明，结果标本染色浓淡适中，囊包和肌纤维轮廓清晰，不足之处是囊内幼虫立体感欠佳。由于二甲苯属于中度毒性的化学试剂，长期使用可对机体构成危害[8，9]，所以，近几年有人用环保透明剂替代二甲苯用于病理组织切片的制片过程[10]，但将环保透明剂应用于寄生虫标本制作尚未见报道。寄生虫标本的制作过程与病理组织切片的制作有不同之处，旋毛虫肌肉幼虫囊包标本采用的是肌肉组织压片而非石蜡切片，所以对标本的透明时间的长短、是否会造成虫体和组织的破坏、标本的长期封固效果均有待进一步观察。

参考文献：

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