泡菜中优良乳酸菌的分离筛选及混菌发酵研究

胡春霞 易明花 陈 燃 陈慧来

(绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴312000)

乳酸菌是能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于人类、动物肠道以及环境中[1〗.乳酸菌发酵食品作为一种营养保健食品已被广大消费者所接受，泡菜就是以乳酸菌发酵生产的传统发酵食品之一.本研究从传统自然发酵的泡菜中分离筛选出优良乳酸菌菌种，通过混菌发酵试验研究其发酵性能，以期为生产乳酸菌纯菌发酵剂、改进传统乳酸发酵食品生产工艺提供技术与方法方面的参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大白菜、雪菜和卷心菜3种泡菜，均为绍兴市地区民间传统腌制的自然发酵泡菜；新鲜卷心菜市售.

草酸铵结晶紫染液：溶液A：结晶紫5 g、95%酒精20 mL；溶液B：草酸铵0.8 g；蒸馏水80 mL；将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用.

革兰氏碘液：碘1.0 g，碘化钾2.0 g，蒸馏水300 mL.

硫酸锌溶液(0.42mol/L)；氢氧化钠溶液(20g/L)；氯化铵缓冲溶液(pH值9.6～9.7)；显色剂[2].亚硝酸钠标准溶液及亚硝酸钠标准使用液[3〗.以上试剂均为分析纯.

1.2 仪器和设备

MJP-150恒温培养箱；YXQ-LS-SII立式压力蒸汽灭菌锅；SW-CJ-1F超净工作台；LD24-1.2离心机；AR2130电子天平；PHS-3C精密酸度计；CX21BIM-SET5生物显微镜；HZQ-Q100全温振荡培养箱.

1.3 培养基

改良MRS液体培养基(菌种保藏、活化用培养基)：酵母膏浸出粉5 g，牛肉浸出粉10 g，KH2PO42 g，K2HPO42 g，柠檬酸铵2 g，醋酸钠5 g，吐温80 1 mL，葡萄糖20 g，维生素C 2 g，L-胱氨酸0.7 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，MgSO41.15 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸馏水至1 L，pH值 6.4.

改良MRS固体培养基(分离用培养基)：在MRS液体培养基中加入1%的琼脂.

1.4 方法

1.4.1 试验流程

泡菜汁→平板稀释涂布分离→纯化→挑单菌落编号保存→优良菌株的筛选→乳酸菌菌株的鉴定→发酵应用实验接种→泡菜发酵→发酵泡菜质量评定.

1.4.2 乳酸菌的分离纯化及初筛

采用10倍稀释法将泡菜汁稀释至10-5.选择10-3、10-4、10-53个稀释度，分别吸取稀释液0.2 mL涂布于改良MRS培养基平板上.每个稀释度2个平板，采用缸烛法加焦性没食子酸改良法置35 ℃兼性厌氧培养48 h.挑取上述平板中长势良好的单个疑似菌落，在改良MRS培养基平板上划线接种连续传代4～6代获得纯化菌株，观察菌落特征，并进行革兰氏染色、芽孢染色实验，挑取革兰氏阳性、无芽孢的单菌落，转至脱脂试管中35 ℃培养24 h，若牛初乳出现凝固，无气泡，呈酸性，初步定为乳酸菌.

1.4.3 乳酸菌的复筛

乳酸的定性分析：取乳酸菌发酵液约5 mL于试管中，加入10% H2SO41 mL，再加入1mL 2% KMnO4溶液，此时乳酸转化为乙醛，再将浸泡在含氨AgNO3溶液中的滤纸条取出放在试管上，将发酵液加热至沸腾，若滤纸变黑则说明有乳酸存在[4,5].

产酸率的测定：参照参考文献[6]进行，结果以乳酸百分含量表示：

乳酸菌发酵液酸度测定：同上方法滴定后，将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为中和100 mL发酵液所需的0.1 mol/L NaOH毫升数，消耗1 mL记为1oT.

用pH计直接测定上述发酵液的pH值.

1.4.4 乳酸菌菌株的生理生化鉴定

参考《微生物分类学》[7]和《伯杰细菌鉴定手册》中的试验方法[8〗，利用细菌微量生化反应鉴定管对复筛出的菌株进行生理学特性试验.生化鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司.

接触酶(过氧化氢酶)反应：取一环改良MRS斜面新鲜培养物涂在干净载玻片上，在菌体上滴加一滴 3 %过氧化氢，观察是否有气泡产生(2～3 min) .

硝酸盐还原试验：将乳酸菌菌株接种到蛋白胨水培养基中，35 ℃恒温培养24 h，再将检测试剂A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2 mL等量混合后，取0.1 mL加入液体培养物中，10 min内观察是否呈现红色.

糖发酵试验：取阿拉伯糖、阿拉伯醇、甘露醇、肌醇、棉籽糖、葡萄糖、10%乳糖、OF(氧化发酵)、乳糖、麦芽糖、ONPG(β-半乳糖苷酶)、果糖、木糖、明胶、紫牛乳发酵管，用接种环以无菌操作挑取纯培养物单个菌落接种，置于35 ℃下培养24～48 h，观察发酵管有无变色现象.

1.4.5 发酵剂的制备

将经过复筛和生化鉴定的优良乳酸菌菌种分别转接活化，扩大培养(培养至菌落浓度约为1.0×107CFU/mL)，3500 r/min离心15 min，弃掉上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，以此作为接种卷心菜的纯种发酵剂.

1.4.6 乳酸菌应用研究

卷心菜乳酸发酵：清洗干净，无菌条件进行适当切分，接种发酵剂(5 %的接种量)，注入4 %食盐水(加以适量的调料)发酵(37 ℃，3 d).试验设纯种发酵组(热烫处理卷心菜)、自然发酵组(不作热烫处理卷心菜)，纯种发酵组包括单菌种发酵组和混菌发酵组.泡菜从气味、风味、口感、脆性、颜色等感官指标进行质量评定[9〗，测定活菌总数、亚硝酸盐的含量、pH值等指标，与自然发酵组进行比较.

1.4.7 亚硝酸盐测定

测定原理：在弱酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，然后与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，呈色深浅与亚硝酸盐含量成正比[10〗，在一定波长下测定其吸光度，与标准曲线比较定量.标准曲线的制作、样品制备及亚硝酸盐的测定参照梁慧锋的方法[11〗.利用下式计算亚硝酸盐含量[12〗：

ω=χν1/mν2.

式中，ω为样品中亚硝酸的含量(μg/g)；m为取样质量(g)；χ为样品液中与标准系列中相当量的亚硝酸盐(μg)；ν1为样品处理液的总体积(mL)；ν2为测定用样液的体积(mL).

2 结果

2.1 优良乳酸菌的筛选

经过多次分离纯化，共从3种泡菜样品中获得14株长势良好、菌落特征与乳酸菌相似的菌株，分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、B1、B2、B3、B4、B5、B6.通过试验筛选出10株革兰氏阳性、无芽孢的纯菌株A1、A3、A4、A6、A8、B2、B3、B4、B5、B6，经乳酸定性分析和产酸量定量分析发现其中有10个菌株发酵液中含有乳酸，初步说明分离获得的10个菌株为产乳酸菌.从表1中可以看出，A1、 B3、B4三个菌株产酸能力最强，可作为备选菌株.

表1 各菌株产乳酸的定性分析及其产酸量的定量分析

注：+ 阳性反应，即产乳酸

2.2 菌株A1、 B3、B4的形态学特征

经菌落形态特征观察结果(表2)显示，所选产酸较高的A1、 B3、B4菌株均为无芽孢杆菌，形态特征和乳酸菌相符.

表2 乳酸菌筛选菌株的形态特征

2.3 菌株A1、 B3、B4的生化特征

进一步对这3株菌进行生化鉴定结果如表3所示，依据《伯杰细菌鉴定手册》，凡是革兰氏染色阳性、触酶试验阴性、硝酸还原试验阴性、石蕊牛乳试验阳性，在改良MRS培养基上菌落周围形成明显的透明环的分离菌，可初步判定为乳酸菌.再综合形态学、生化试验鉴定结果，可初步确定菌株A1属于保加利亚乳杆菌，B3属于短乳杆菌，B4属于嗜酸乳杆菌.

表3 乳酸菌筛选菌株的生理生化鉴定特征

续表：

实验项目A1B3B410%乳糖+++OF+++乳糖-++麦芽糖-++ONPG---果糖+++木糖醇-+-蔗糖-++明胶---

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性

2.4 菌株对发酵卷心菜泡菜品质的影响

2.4.1 感官评定

利用分离鉴定出的三种菌株A1、 B3、B4设置纯种发酵、两两菌株混菌发酵以及三菌株混菌发酵组发酵制备卷心菜泡菜，运用感官评定结果表明(表4)：纯种发酵泡菜味道较自然发酵的好，混菌发酵泡菜的风味要优于纯种发酵泡菜，其中三菌株混菌发酵泡菜的各项品评项目均为最优，而纯种发酵中B4菌株发酵出来的泡菜口味稍差.

表4 卷心菜泡菜的感官评定

2.4.2 pH值测定

分别测定混菌发酵、纯种发酵及自然发酵组24 h、48h和72h三个不同发酵时间的pH值，结果如表5所示.从表5可以发现，纯种发酵的泡菜pH值在48 h的时候已经降到3.5以下，而自然发酵组在72 h时才降到相近pH值，因而人工接种发酵泡菜可明显缩短发酵周期.另外，混菌发酵的泡菜在48 h时pH值明显低于纯种发酵.一般将泡菜pH值降至3.5时，认为泡菜发酵成熟.因此，使用纯菌或混菌发酵剂可大大缩短发酵周期，节省时间.

表5 各发酵组不同时期的pH值测定

2.4.3 活菌计数

分别取混菌发酵、纯种发酵及自然发酵各组在24 h、48h和72h时的发酵液进行活菌计数，结果见表6.由表6可知，人工发酵1～2天活菌数量处于增长趋势；48 h后活菌数量平缓或减少，而自然发酵活菌数量在72 h内一直处于增长趋势.说明接种一定量的乳酸菌发酵剂后，活菌数量高，利于泡菜的发酵.

表6 各发酵组不同时期的菌落计数

2.4.4 亚硝酸盐测定

以亚硝酸盐浓度为纵坐标，不同浓度亚硝酸盐的吸光度为横坐标，得到亚硝酸盐的标准曲线( 图1).由图1可知，亚硝酸盐浓度与吸光度的线性关系良好，回归方程为χ=51.802A -0.0901(R2=0.9978)，其中χ指亚硝酸盐含量，A指吸光度.

表7各发酵组不同时期的亚硝酸盐含量

发酵组别亚硝酸盐含量(μg/g)第一天第二天第七天自然发酵组20.8315.387.72A1菌株纯种发酵组5.413.121.53B3菌株纯种发酵组6.584.073.47B4菌株纯种发酵组5.234.612.15A1、B3混菌发酵组3.172.080.59A1、B4混菌发酵组3.021.200.41B3、B4混菌发酵组3.282.310.60A1、B3、B4混菌发酵组3.112.180.39

从表7 可以看出，在自然发酵泡菜中亚硝酸盐含量明显高于人工发酵的泡菜，第一天亚硝酸盐含量最高为20.83 μg/g，随着发酵时间的增长，亚硝酸盐含量迅速降低至7.72 μg/g.而人工发酵泡菜从第一天开始直到成熟，亚硝酸含量不明显，其中三菌株混菌发酵组第7天时亚硝酸盐含量为0.39 μg/g，比自然发酵的降低94.95%.

3 结论

泡菜是一种常见的乳酸菌发酵食品.一直以来，传统高盐腌制泡菜加工工艺生产周期长、成本较高和风味差的缺点限制着泡菜的工业化发展.而低盐腌制的泡菜又存在着品质不稳定、亚硝酸盐含量容易超标，容易污染有害微生物等缺点、因此人工接种发酵泡菜就成为大家研究的方向.

研究发现，人工接种菌种发酵泡菜，不仅可以提高泡菜的口感，还可大大降低泡菜中亚硝酸盐残留量.这是因为，随着泡菜腌制时间的延长，泡菜的pH值降低，促进了亚硝酸盐的降解，使泡菜中亚硝酸盐的含量降低.而人工接种乳酸菌的含量远高于自然发酵泡菜中的乳酸菌含量，发酵乳酸生成快，使环境中的pH值迅速降低，抑制或杀死其中一些不赖酸的病原菌及有害菌生长[13].同时，硝酸还原酶的适宜pH值为7.0～7.5，随着环境酸度增加，pH值降低，还原酶活性降低，甚至无活性，促使亚硝酸盐降解，从而减少亚硝酸盐与二级胺反应生成致癌物质—亚硝胺[1,4,15〗.

本试验从绍兴地区三种民间传统发酵泡菜中分离优选出3株高产酸菌株A1、 B3和B4，经形态学及生化特性初步鉴定，3株分别是短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌.

泡菜是以各种时鲜蔬菜为原料，入泡浸液经乳酸菌发酵泡浸成菜。因此本实验以卷心菜为代表对这三株菌进行发酵性能的研究，结果发现，人工接种发酵泡菜可以很好解决蔬菜低盐腌制发酵过程中品质不稳定、亚硝酸盐含量超标等问题；而且和自然发酵、单菌株发酵相比，混菌发酵解决人工接种单菌发酵泡菜口感较差，风味不够丰厚饱满的缺点，是一条值得继续探索的途径.

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