水果中阿斯巴甜的研究

金建秀 ，刘东华，石 杰，杜 平

新疆中基天然植物纯化高新技术研究院有限公司，乌鲁木齐830088

阿斯巴甜(Aspartame，APM，C14H18N2O5)，学名是天门冬酰苯丙氨酸甲酯，俗称甜味素。最早由美国G.D.Searle 公司的研究人员在合成促胃液分泌激素时偶然发现其甜味，成为二肽类中第一个被发现有甜味的物质。由于其甜度高、热量低、无不良后味和易与酸味食品调和等特点被广泛用作食品、饮料的甜味剂。自1981 年美国食品和药品管理局核准通过使用后，该甜味剂已经在超过100 个国家使用。

目前对阿斯巴甜的研究集中在合成［1］、应用［2］、安全性［3，4］及含量检测［5-8］方面，对于天然植物中是否存在阿斯巴甜，在合成阿斯巴甜方法中必须的前体分子苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)［9-11］和甲醇在水果中是否存在，与阿斯巴甜的对应关系尚未见报道。本文根据HPLC-QQQ-MS/MS 具有定性、定量及筛选能力强的特点，用HPLC-QQQ-MS/MS 分别对猕猴桃等8 种水果中的苯丙氨酸、天冬氨酸和阿斯巴甜进行测定，用HS-GC 分别对8 种水果中的甲醇进行测定。并进行模拟合成实验，通过对合成产物进行测定，从化学角度对阿斯巴甜在水果中是否存在进行探讨。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent RRLC1200 高效液相色谱仪，Triple Quad LC/MS 6410 三重四极杆串联质谱仪，Agilent6890N GC 气相色谱仪配有7694E 顶空进样器、FID 检测器(美国安捷伦科技公司);BS210S 电子天平(赛多利斯);匀浆机HR1617(飞利浦);离心机GT10-1(北京时代北利离心机有限公司);PHS-3B酸度计(上海雷磁)。

甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯，购于美国TEDIA 公司;天冬氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜均＞99%，购于德国Dr.Ehrenstorfer 公司;丹酰氯＞95%，购于美国Sigma 公司;碳酸钾、乙酸、乙酸铵、乙腈均为分析纯，购于天津市福晨化学试剂厂;橙、猕猴桃、桔、菠萝、芒果、苹果、香梨、香蕉均购自市场。

1.2 标准溶液的配制

苯丙氨酸和天冬氨酸标准溶液:准确称取苯丙氨酸和天冬氨酸标准品各10.0 mg 分别于2 个100 mL 容量瓶中，加入2 mL 水及5 滴10%碳酸钾溶液溶解，定容至刻度，制成100 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸标准储备液。分别移取两种标准储备液5.0 mL 于2 个100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到5.0 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸工作液。

阿斯巴甜标准溶液:准确称取阿斯巴甜标准品10.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用pH = 4.5 的缓冲溶液(乙酸-乙酸铵)定容至刻度，得到100 mg/L 的标准储备液。将此标准储备液用缓冲溶液逐级稀释成0.5、5.0、10.0、50.0 μg/L 的工作液。

丹酰氯标准溶液:准确称取丹酰氯标准品50.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得500 mg/L 的工作液。

甲醇标准溶液:准确称取甲醇100 mg 于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到1.0 g/L 的甲醇标准储备液。移取此储备液2.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到200 mg/L 的甲醇标准溶液。

1.3 样品制备

1.3.1 测定水果中pH 值的样品制备

将水果去皮切碎，与水按质量比1∶2 的比例进行匀浆，取匀浆后样品适量，于9000 rpm 转速下离心5 min，取上清液，用pH 计测定其pH 值。

1.3.2 测定水果中甲醇含量的样品制备

取1.3.1 中制备的匀浆样品两份，每份8.0 g，分别至2 个20 mL 顶空瓶中，一份加1.0 g/L 甲醇溶液2.0 mL，得到甲醇浓度为200 mg/L 的加标样品;另一份加蒸馏水2. 0 mL，得到空白样品。用GC-HS 分析。

1.3.3 测定水果中阿斯巴甜含量的样品制备

取1.3.1 中制备的匀浆样品15 mL，加入20%乙腈溶液15 mL，混匀，于9000 rpm 转速下离心5 min 后，移取样品上清液于2 个10 mL 容量瓶中，每份5.0 mL，一份加50.0 μg/L 阿斯巴甜标准液2.0 mL，用缓冲液定容至刻度，得到浓度为10.0 μg/L的加标样品;另一份用缓冲液定容至刻度，作为空白样品。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4 测定天冬氨酸和苯丙氨酸含量的样品制备

1.3.4.1 测定2种氨基酸标准溶液反应液中衍生物含量的样品制备

分别移取5.0 mg/L 的天冬氨酸标准溶液5.0 mL 和5.0 mg/L 苯丙氨酸标准溶液1.0 mL 于2 个试管中，并在苯丙氨酸溶液的试管中加4.0 mL 水，再分别向两支试管中加500 mg/L 的丹酰氯标准溶液1.0 mL，滴加10%碳酸钾溶液，使试液pH 为9.5左右，最后各加乙腈5 mL，于35 ℃水浴中暗反应1 h。将反应液分别移至2 个100 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液。移取上述两种氨基酸衍生物溶液各1.0 mL 于1 个10 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到浓度为25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合标准溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4.2 测定水果中2 种氨基酸衍生物含量的样品制备

移取1.3.3 制备的样品上清液0.5 mL，定容至10 mL(试液I)。分别移取试液I 0.2 mL 至2 个试管中，一份加0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液各1.0 mL，另一份加2 mL 水。分别向两支试管中滴加10%碳酸钾溶液，调试液pH 至9.5 左右，再各加500 mg/L 的丹酰氯标准溶液5.0 mL，最后各加乙腈1 mL，于35℃水浴中暗反应1 h。将反应液分别移至2 个10 mL 容量瓶中，定容至刻度。得到一份浓度为25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合样品溶液，另一份为空白样品溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.5 测定模拟合成反应中阿斯巴甜含量的样品制备

移取5.0 mg/L 的天冬氨酸及苯丙氨酸标准溶液各5 mL 于一个试管中，加入2 mL 甲醇和0.2 mL乙酸，再加约3 mL 水，在50 ℃水浴下反应8 h。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.4 液相-质谱条件

1.4.1 测定氨基酸衍生物的液相条件

Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)。流动相:A 为含0.1%甲酸的水溶液;B 为甲醇。梯度洗脱程序:0～1.0 min，35%B;1.0～3.0 min，35%B～90%B;3.0～ 8. 0 min，90%B;8.0～8.1min，90%～35%B。流速:0.2 mL/min。柱温:40 ℃。进样量:5 μL。

1.4.2 测定阿斯巴甜的液相条件

色谱柱、流速、柱温、进样量与1.4.1 相同。流动相:0.1%甲酸水溶液-甲醇(82:18，V/V)。

1.4.3 质谱条件

离子源:ESI+模式;监测模式:MRM;电喷雾电压:4000 V;雾化气压力:2.76 ×105Pa;反吹气温度:350 ℃，其它质谱参数见表1。

表1 天冬氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能量Table 1 Parent ion，product ion，fragmentor and collision energy of MS for aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame

图1 5.0 μg/L 阿斯巴甜(APM)标准溶液与8 种水果空白样品中阿斯巴甜的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of aspartame in aspartame standard solution (5.0 μg/L)and eight kinds of fruit samples

1.5 气相色谱-顶空进样条件

1.5.1 气相色谱条件

DB-WAX 色谱柱(30 m × 0. 32 mm × 0. 25 μm);柱流量:1.5 m/min;分流比:5∶1;进样口温度:200 ℃;柱温:60 ℃;FID 检测器温度:250 ℃。

1.5.2 顶空进样器条件

样品平衡时间:20 min;样品平衡温度:60 ℃;定量环温度:80 ℃;加压时间:0.2 min;定量环平衡时间:0.05 min;进样时间:1.0 min;定量环充样时间:0.2 min;传输线温度:90 ℃。

2 结果与讨论

2.1 LC-QQQ-MS/MS 条件的优化

在阿斯巴甜的检测中，甲酸浓度显著影响阿斯巴甜的保留时间，浓度增高保留时间延长;添加甲酸铵则会明显抑制阿斯巴甜的离子化。此外，多种样品基质会产生m/z 120 的干扰峰，通过调节流动相比例，能使目标峰与干扰峰完全分离。经过优化，选择1.4.2 条件，能兼顾运行时间和分离度的要求(见图1)。

对样品中天冬氨酸和苯丙氨酸的测定是通过将其衍生化反应后测定其衍生物来实现的。两种氨基酸衍生物在色谱柱上的保留差别很大，天冬氨酸衍生物保留较弱，苯丙氨酸衍生物保留很强，实验证实流动相中甲酸和甲酸铵的含量对其分析影响不大。选择1.4.1 条件，能兼顾运行时间和分离度的要求(见图2)。

本实验中，阿斯巴甜在ESI+和ESI-电离模式下均具有较强的质谱信号，其ESI+模式质谱信号略强于ESI-模式的，天冬氨酸衍生物和苯丙氨酸衍生物在ESI+模式下具有远强于ESI-模式下的质谱信号，因此均选用ESI+电离模式进行测定。采用MRM 监测模式，阿斯巴甜和两种氨基酸衍生物的母离子经碰撞后产生一系列子离子，通过对碎裂电压和碰撞能量的优化，选择响应最高的一组离子为定性和定量离子。优化后的质谱参数见表1。

图2 25.0 μg/L 天冬氨酸(Asp)和5.0 μg/L 苯丙氨酸(Phe)衍生物的混合标准溶液与8 种水果空白样品中天冬氨酸及苯丙氨酸衍生物的MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of aspartic acid derivative and phenylalanine derivative in mixed standard solution (25.0 μg/L for aspartic acid derivative，5.0 μg/L for phenylalanine derivative)and eight kinds of fruit blank samples

2.2 基质效应

基质效应(Matrix Effect)，即指样品中除分析物以外的共流出组分改变了分析物的响应值，从而影响定量分析的准确性与重现性。实验中用加标样品的峰面积与空白样品的峰面积的差值占加标浓度的标准溶液的峰面积的百分比来计算衡量［12］，大于100%表示基质增强效应，小于100%表示基质抑制效应。8 种水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的基质效应影响如图3 所示。

2.3 HS-GC 条件的优化

本实验主要优化柱温，经比较60 ℃的柱温较合适，能做到目标物峰与杂峰的基线分离(见图4)。

图3 8 种水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸(Asp)和苯丙氨酸(Phe)衍生物及阿斯巴甜(APM)的基质效应Fig.3 Matrix effects of aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame by LC-QQQ-MS/MS in the eight kinds of fruit simples

图4 200 mg/L 甲醇标准溶液和8 种水果空白样品中甲醇的GC 色谱图Fig.4 GC chromatograms of methanol in methanol standard solution (200 mg/L)and eight kinds of fruit blank samples

2.4 定量方法的选择

因基质效应的影响，定量方法采用标准加入法。在实验中，为提高定量结果准确度，尽量使加标溶液浓度与样品浓度接近。天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的峰面积从提取离子流图(EIC)中获取(可以有效消除杂质峰的干扰，提高定量准确性)，甲醇的峰面积从GC 色谱图中获取。计算方法如下:

Pi=Ai/(As+i-Ai)×Cs×F

Pi:样品中组分i 的含量，mg/kg 或μg/kg;

Cs:加标溶液的浓度mg/kg 或μg/kg;

Ai:样品中组分i 的峰面积;

As+i:加标样品的峰面积;

F:稀释因子。

2.5 样品的测定

2.5.1 8 种水果样品pH 值的测定

取1.3.1 中制备的样品上清液测定pH 值，结果见表2。

实验结果表明8 种水果样品提取液均呈弱酸性，而弱酸性环境对阿斯巴甜的稳定存在是有利的。

2.5.2 8 种水果样品中甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸含量的测定

分别按1.3.2、1.3.4、1.3.3 的方法制备样品，测定水果及其加标样品中的甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。结果(见表3)表明，8 种水果均含有甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。

表2 8 种水果样品的pH 值Table 2 pH values of eight kinds of fruit samples

表3 8 种水果中甲醇、天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)和阿斯巴甜(APM)的含量Table 3 The contents of methanol，aspartic acid(Asp)，phenylalanine(Phe)and aspartame(APM)in eight kinds of fruit

2.5.3 模拟合成反应产物中阿斯巴甜的测定

在模拟合成反应中，用甲酸代替水果中常见的柠檬酸或苹果酸，该体系若能产生一些缩合产物，可以预期将是比较复杂的混合物。按照1.3.5 方法模拟合成反应实验后进样测定。结果(见图5)表明，反应液的MRM 色谱图中存在与阿斯巴甜标准溶液谱图中保留时间相同的色谱峰，再将产物与阿斯巴甜标准溶液的MRM 色谱图进行比较:定量离子与定性离子相同;定量与定性离子丰度比率相近，因此，可以确认模拟合成反应中有阿斯巴甜生成，约1.4 μg/L。模拟反应实验证明，在酸性环境条件下，当体系中具备合成阿斯巴甜的前体分子，是可以形成阿斯巴甜的。但是，果实中阿斯巴甜的浓度比实验反应生成的浓度高许多，这与生物系统合成有机物的高效性是否相关，目前尚不清楚。

3 结论

图5 反应液与5.0 μg/ L 阿斯巴甜标准溶液匹配后的MRM 色谱图Fig.5 MRM chromatograms of aspartame in the reaction solution and aspartame standard solution (5.0 μg/L)after chromatographic peak matching

本文采用高效液相色谱-串联质谱技术建立了水果中天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜的分析方法，采用顶空-气相色谱技术建立了水果中甲醇的分析方法。将所建立的方法用于测定8 种水果中的目标成分，结果显示8 种水果中均存在阿斯巴甜、天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇，其中甲醇、天冬氨酸和苯丙氨酸的含量差异较大，而阿斯巴甜的含量差异不大，两者缺乏对应关系。设计阿斯巴甜的模拟合成实验，表明阿斯巴甜有在水果中合成的可能。

1 Qian YJ(钱亚杰)，Qian ZW(钱志伟). Study on the synthesis of aspartame.Hebei Chel Eng Ind(河北化工)，2007，30:38-40.

2 Wu PQ(吴璞强)，Zhao GX(赵桂霞)，Zhang YN(张亚楠)，et al.Research progress of aspartame on application and synthesis.Chin Cond(中国调味品)，2010，35:30-32.

3 Wurtman RJ. Neuro chemical changes following high-dose aspartame with dietary carbohydrate. N Eng J Med，1985，309:429-430.

4 Song Y(宋雁)，Fan YX(樊永祥)，Li N(李宁).Advances on the safety assessment of aspartame.Chin J Food Hyg(中国食品卫生杂志)，2010，22:84-87.

5 Ji C(嵇超)，Feng F(冯峰)，Chen ZX(陈正行)，et al.Determination of five synthetic sweeteners in wines use high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Chin J Chromatogr(色谱)，2010，28:749-753.

6 Yang LH(杨柳桦)，Wang L(王林)，Sun CJ(孙成均).Determination of aspartame by high performance liquid chromatography in health foods and drinks.Chin J Anal(分析实验室)，2007，26:79-82.

7 Galletti GC，Bocchinib P，Gioacchini AM，et al. Analysis of the artificial sweetener aspartame by means of liquid chromatography/electrospray mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom，1996，10(9):1153-1155.

8 Xiao L(肖琳)，Liu CM(刘赐敏)，Zhou JS(周金森)，et al.Determination of acesulfame potassium，saccharin sodium and aspartame in drinks by HPLC.Chin J Health Lab Technol(中国卫生检验杂志)，2011，21:1120-1122.

9 Cui JD(崔建东)，Zhao GX(赵桂霞)，Zhang YN(张亚楠)，et al. Primary screening of aspartame synthesizing strains.Chin Cond (中国调味品)，2010，35:102-104.

10 Zhou GY(周桂友)，Hou YF(侯艳芳)，Dong XJ(董新吉).RP-HPLC deternination of amino acids with precolumn derivatization.PTCA，Part B:Chem Anal(理化检验-化学分册)，2011，47:889-893.

11 Yu XJ(于学娟)，He J(贺晶)，Yang AH(杨爱华)，et al.Amino acids column before derivative HPLC analysis of chromatographic condition optimizing. Chin Cond(中国调味品)，2011，36:87-89.

12 Wang LZ(王连珠)，Zhou Y(周昱)，Chen Y(陈泳)，et al.Evaluation QuEChERS of method for the analysis of 66 organophosphorus pesticide residues in vegetables by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Chin J Chromatogr(色谱)，2012，30:146-153.