Bloom解旋酶突变体的克隆与表达

张金彪 许厚强 骆衡 许庆贺 陈祥 李坤

（1.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室 动物科学学院，贵阳 550025；3.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室 动物科学学院，贵阳 550025）

DNA解旋酶是解开DNA双螺旋结构的酶，在DNA的复制、修复、重组、转录、维持染色体稳定性等细胞代谢过程中都具有非常重要的作用［1-3］。RecQ解旋酶家族是DNA解旋酶中的一个重要家族，人类RecQ解旋酶缺陷会引起遗传不稳定，导致相关疾病如癌症［4，5］的发生。在人体中已经发现RecQ1、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五种RecQ解旋酶，其中BLM、WRN、RecQ4缺陷会相应的引起Bloom综合症（BS）、Werner（WS）和Rothmund-Thomson综合症（RTS）［6，7］。

BS是一种常染色体隐性遗传疾病，其临床特征表现为身躯矮小，出生前或出生后引起的生长阻滞，面部有对光敏感的红斑，女性的生育能力较低，男性不育，免疫缺陷及易患多种癌症［8，9］。BLM解旋酶由1 417个氨基酸组成，BLM解旋酶在DNA解链过程中表现为3'-5'极性，而且可以解开多种DNA，包括3'端有缺口的双链DNA、泡状DNA、带有复制叉的双链DNA、G-四链体DNA、D型环状DNA及霍利迪结构DNA［10-13］。先前的研究已经证明BLM解旋酶的RecQ核心区域（642-1 290氨基酸序列）具有与全酶的相似活性［14］。

BLM解旋酶的核心区域主要包括解旋酶结构域，C-末端保守序列（RecQ-Ct）和解螺旋酶RNA酶D C-末端结构域（HRDC）3个结构域［15］。解旋酶结构域主要是由7个保守的氨基酸基序（motif）组成，其功能主要是间接或直接地结合DNA并诱导催化水解而促使解旋酶的易位和解链［16-18］。RecQCt结构域有一个平台型结构，其中心是由4个半胱氨酸和一个Zn2+离子组成的α-螺旋结构，侧翼由螺旋状的基序组成。RecQ-Ct结构域的功能是BLM解旋酶与DNA的结合位点并介导其与参与DNA代谢的相关作用因子相互作用［17，19，20］。解旋酶结构域和RecQ-Ct结构域结合在一起形成了具有催化作用的解旋酶核心结构域，其包含有ATP酶活性和DNA结合活性的必须的基序和结合位点［20］。HRDC结构域位于解旋酶的C-末端，通过辅助结合DNA来调节解链功能，且可促进并稳定BLM解旋酶与DNA的结合，但不具有催化活性［20］。

BS患者的BLM的RecQ-Ct结构域中的1 036位半胱氨酸突变已经有报道，国际上已有研究报道单个半胱氨酸的突变对BLM解旋酶的生物活性的影响，但是多个位点同时突变的突变体活性研究尚无报道［15，21］。RecQ-Ct结构域单点突变的研究表明了突变对酶活性有影响，但对ATPase和解链活性的影响有区别，其结果显示，RecQ-Ct结构域对解旋酶结构域的活性有调节作用，但具体机制还不清楚［15，20］。本研究通过在BLM解旋酶结构域985位和RecQ-Ct结构域1 036位氨基酸残基位点同时引入突变，构建双突变的重组大肠杆菌，运用IPTG诱导其表达，在体外分离纯化双突变型BLM解旋酶，并对其进行Western blotting鉴定，旨在为进一步研究BS的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BLM642-1290重组大肠杆菌BL21菌株由法国巴黎第十一大学居里研究所的奚绪光主任研究员馈赠；质粒回收试剂盒、DNA快速胶回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司；BL21（DE3+）菌株、Top10菌株、pMD®19-T Vector、pET-28a 质粒、dNTP、Pfu高保真酶购自TaKaRa；2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中blm基因cDNA序列（CCDS10363.1），采用Primer Premier 5.0设计引物F和R，分别作为BLM642-1290的上下游引物：F1和R1互补，且都带有一个突变位点985位密码子GAA→GGA；F2、和R2互补，且都带有一个突变位点1 036位密码子TGC→TTC，引物由上海生工生物技术有限公司合成，去离子水溶解，-20℃保存。3对引物序列如表1所示。

表1 重组PCR引物序列

1.2.2 PCR重组构建突变基因

1.2.2.1 985位突变基因的构建 提取BLM642-1290重组大肠杆菌BL21菌株质粒，以提取的质粒为模板，以F、R1为引物Pfu高保真酶扩增上游片段P1，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min。以F1、R为引物Pfu高保真酶扩增下游片段P2，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min。

胶回收上下游片段P1、P2，P1、P2以11比例混合Pfu高保真酶扩增重组基因，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，10个循环；72℃延伸7 min。反应完毕，加入引物F、R，94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min，扩增产物命名为T1，胶回收T1。

1.2.2.2 双突变基因的构建 以T1为模板，以F、R2为引物Pfu高保真酶扩增上游片段P3，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min。以F2、R为引物Pfu高保真酶扩增下游片段P4，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min。

胶回收上下游片段P3、P4和P3、P4以1∶1比例混合Taq酶扩增重组基因，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，10个循环；72℃延伸7 min。反应完毕，加入引物F、R，94℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸7 min，扩增产物命名为T2，胶回收T2。

1.2.3 突变基因的克隆 将回收的T2与pMD®19-T Vector 按试剂盒说明书反应，构建重组质粒。构建好的重组质粒转化感受态Top10菌株，筛选阳性克隆。挑取阳性克隆菌落扩培提取质粒测序。

1.2.4 突变表达载体pET-28a-BLM642-1290的构建及菌株的保存 测序鉴定正确的突变体T克隆菌株接入液体培养基中培养，12 h后提取质粒，XhoⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶双酶切，凝胶电泳，回收2000 bp DNA产物；双酶切pET-28a空载体，胶回收酶切产物。按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明切胶回收目的片段，将回收的pET-28a与突变BLM642-1290突变基因进行定向连接，连接产物重组表达质粒pET-28a-BLM642-1290转化感受态细胞E. coli BL21（DE3+）。扩培菌体提取质粒，采用限制性内切酶Xho I、EcoR I对提取的重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系同pET-28a质粒的酶切体系，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时以提取质粒为模板，F、R为引物进行PCR鉴定。

1.2.5 重组蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定 将重组大肠杆菌按11 000接种于2 mL含氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基，37℃培养过夜，次日以1∶100转接入含100 μL/mL Amp的LB中，37℃振摇至OD600为0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，18℃继续培养18 h后，离心收菌，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，离心1 min，上清用于SDS-PAGE检测蛋白表达情况。分离胶浓度为10%，浓缩胶为5%，120 V电泳约2 h，考马斯亮蓝染色。Western blotting检测融合蛋白的免疫原性，以12 000稀释His-tag一抗，12 500稀释的标记辣根过氧化物酶的抗羊血清为二抗，化学发光试剂盒显色。

2 结果

2.1 PCR重组构建突变基因

运用PCR对blm基因进行重组构建，理论上第一轮PCR上游片段P1为1 032 bp，下游片段P2为915 bp，重组后T1全长1 947 bp；第二轮重组PCR上游片段P3为1 185 bp，下游片段P4为762 bp，重组后T2全长1 947 bp。试验其结果见图1和图2，PCR产物琼脂糖凝胶检测显示得到的目的条带大小与理论值一致，由以上结果可知突变型的blm基因构建成功。

2.2 测序结果在NCBI中的BLAST分析

对构建好的突变基因进行测序，并对序列进行在线分析，利用BLAST-N程序在GenBank数据库中进行相似性检索。结果（图3）显示，与正常BLM基因序列对比，blm基因985位密码子由GAA（Glu）突变为GGA（Gly），1 036位密码子TGC（Cys）突变为TTC（Phe）。同时其他片段无随机突变发生，结果显示突变基因构建成功。

2.3 重组表达质粒酶切鉴定

提取重组大肠杆菌质粒，采用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，同时以提取质粒为模板，F、R为引物进行PCR鉴定。结果（图4）显示，2 000 bp左右均有目的基因片段。说明突变基因已经成功的连入表达质粒中。

2.4 重组蛋白的表达

融合蛋白的大小约72 kD，纯化后表达产物经SDS-PAGE后转移至PVDF膜上进行Western blotting，结果（图5，图6）显示，表达产物能被His-tag抗体识别，在约72 kD 处显示明显的条带，证明目的基因在载体中成功表达。

3 讨论

目前我们已经研究了野生型BLM解旋酶在体外表达的生物学性质［22，23］。本研究通过重组PCR成功构建了BLM642-1290解旋酶定点突变基因，并将其克隆至原核表达载体中进行表达，经蛋白印记验证，得到了目的蛋白。

临床发现，BLM解旋酶核心区域的7个氨基酸位点突变会引发BS，5个位于解旋酶活性中心结构域，两个位于RecQ-Ct结构域的半胱氨酸位点［24］。这为研究BLM在BS中的作用提供了充分的证据，但是其在细胞代谢中的具体机制尚不清楚。

通过体外构建定点突变基因，可以迅速获得突变体研究所需的材料，分析分子机理。传统的体外定点突变技术多采用寡核苷酸引物介导的突变法，突变仅仅限于5'端 ，PCR技术的发展提供了体外定点突变的新手段，可在DNA片段的任何位置定点突变［25］。本试验在操作中，减少其他位点随机突变的可能性，在第二次PCR扩增时采用纯化后的上下游基因片段作为模板，优化复性与延伸温度。通过重组PCR进行基因突变克隆，操作简便，只需进行常规的PCR操作，引物无需磷酸化，成本低效率高，能100%在希望突变的位点引入特定的突变。而且本试验以第一次回收的PCR产物作为模板，在第一个突变的基础上再次引入第二个突变，简化了试验操作；理论上需要引入几个突变就可以通过几次重组PCR来实现，只需采用常用的试验技术即可达到试验目的。测序结果表明，在预定位置引入了定点突变，因此设计是合理的。

4 结论

本试验利用PCR技术将blm基因第985位密码子和1 036位密码子成功进行了定点突变，并得到了纯度较高的双突变BLM解旋酶，为下一步的工作将研究突变蛋白的生物活性奠定了基础，从而在蛋白质水平上进一步阐明突变导致BS的发病机制以及探讨BLM解旋酶结构和功能之间关系。

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