海洋真菌梅花状青霉FS83抗菌抗肿瘤活性研究

李浩华 陈玉婵 王磊 章卫民

（广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，广州 510070）

微生物发酵产物一直是医药上的重要资源，但近年来随着陆地资源的不断开发，筛选新的微生物资源、寻找新的活性代谢产物难度越来越大［1］。海洋约占地球表面积的71%，蕴藏丰富的微生物资源，是开发药物的重要源泉。海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分，不但种类多，分布广，而且生活在海洋高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特殊环境中，能产生陆栖微生物所不能产生的结构新颖、作用特殊的活性代谢产物［23］。因此，海洋真菌资源具有重要的研究和开发价值，是寻找药物先导化合物的重要来源。为了发掘海洋来源的药用真菌资源，本课题组对分离自南海沉积物的海洋真菌进行筛选，发现梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83具有生长速度快、提取物得率高、代谢产物丰富等特点。为了进一步探讨梅花状青霉的生物活性，本研究拟探讨梅花状青霉FS83的发酵液和菌丝体提取物对4种细菌、5种真菌和3种肿瘤细胞株的抑制活性，为进一步开发新的抗菌、抗肿瘤活性物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 海洋真菌FS83从南海（106° 30.295' E，10 0.941' N）1 675 m深处的南海海底沉积物中分离、纯化得到。根据形态学特征和ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为梅花状青霉（Penicillium herquei），其基因登录号为：JQ034358，菌株保存于广东省微生物研究所。

1.1.2 供试菌株及肿瘤细胞株 细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）。真菌：绿色木霉（Trichoderma viride）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、链格孢（Alternaria alternata）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。肿瘤细胞株：人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268。以上菌株和肿瘤细胞株均保存于广东省微生物研究所。

1.1.3 仪器与试剂 PYX-DHS电热恒温培养箱，湖北省黄石医疗器械厂；YXQ.WY21-600电热高压蒸汽灭菌锅，广州市华南医疗器械有限公司；超净工作台，上海恒益科技有限公司；CO2培养箱（SHELLAB公司）、倒置显微镜（OLYMPUS公司）、酶标仪（BIO-TEK公司）、旋转真空蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

无水乙醇（分析纯），广州化学试剂厂； RPMI-1640培养基，Gibco公司；胎牛血清，Gibco公司；双抗（10 000 U/mL青霉素+10 000 U/mL链霉素），Gibco公司；胰酶，Amresco公司；二甲基亚砜（DMSO），Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的发酵与提取物的制备 菌株发酵：将菌株梅花状青霉FS83接种到PDB液体培养基中，26℃，120 r/min培养7 d。提取物的制备：将菌株FS83发酵产物过滤，分离发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取4次，萃取液在40℃下减压浓缩至干，得发酵液提取物浸膏。菌丝体用无水乙醇冷浸多次至提取液基本无色，合并提取液，提取液55℃下减压浓缩至干，得菌丝体提取物浸膏；将两种提取物浸膏用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成50 mg/mL浓度，备用。

1.2.2 抗细菌活性的测定 细菌活化及菌悬液制备：将各供试细菌接种于LB液体培养基中，37℃培养24 h，用无菌生理盐水稀释，配制成105-107CFU/mL浓度的菌液。

抗细菌活性的测定采用滤纸片法［4，5］。取制备好的细菌悬液1 mL放入平板中，倒入已冷却至合适温度的LB培养基，混合均匀。用无菌镊子夹取厚度为1.5 mm、直径6 mm 的滤纸片置于含菌平板上，每个菌种设3皿重复，同时在滤纸片上分别滴提取液10 μL，以DMSO代替样品作空白对照，以浓度为200 μg /mL的硫酸卡那霉素作阳性对照，将平板置于37℃恒温箱培养24 h，用十字测量法测量菌圈直径的大小，计算抑菌圈的平均值。

1.2.3 抗真菌活性测定 真菌的活化：分别挑取各供试真菌斜面菌种一小块接种于PDA平板中，28℃恒温箱培养72 h。

抗真菌活性的测定采用生长速率法［6］。取浓度为50 mg/mL的样品提取液0.1 mL均匀涂布到含PDA固体培养基的培养皿中，在平皿中央分别接入直径为4 mm的绿色木霉、黑曲霉、黄曲霉、链格孢、胶孢炭疽菌的菌饼，每处理重复3皿，以DMSO代替样品作空白对照。置于28℃恒温培养箱培养72 h，用十字测量法记录菌饼生长直径，计算抑制率。

抑制率（%）=（1-处理组纯生长量/对照组纯生长量）×100%，其中纯生长量（mm）=菌饼生长直径-4。

1.2.4 最低抑菌浓度的测定 最低抑菌浓度的测定采用连续稀释法［7］。提取液按试管二倍稀释法，将细菌用LB液体培养基，真菌用PDB液体培养基按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32以及1∶64 mg/mL比例稀释，提取液浓度分别为25、12.5、6.25、3.125、1.5625及0.7812 mg/mL。吸取不同浓度的提取液100 μL于试管中，再分别加入100 μL菌液，使细菌的含菌量达106-107CFU/mL，真菌含孢子数106-107个/mL，细菌以LB液体培养基，真菌以PDB液体培养基分别代替提取液作为空白对照组。细菌置于30℃恒温箱培养24 h，真菌置于28℃恒温箱培养72 h，然后于含相应培养基的平皿上划线培养，细菌培养24 h，真菌培养72 h，观察生长情况。以试管澄清，划线培养不长菌的浓度为最低抑菌浓度（MIC值）。

1.2.5 肿瘤细胞毒活性测定 采用MTT法测定［8］。分别取对数生长期的NCI-H460细胞、MCF-7细胞、SF-268细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥试验检测细胞活力大于95%后，用新鲜培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，将细胞分别接种于96孔板，每孔加入180 μL的细胞悬液，并设3个空白调零孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，每孔分别加入20 μL浓度为200 μg/mL提取物稀释溶液，阴性对照加20 μL RPMI-1640培养基，阳性对照加20 μL浓度为10 μg/mL顺铂溶液，每孔设3个重复。置CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL MTT溶液，37℃培养4 h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使紫蓝色结晶完全溶解后，用酶标仪测定每孔490 nm吸光值（OD490），取3孔平均吸光值，按以下公式计算提取物对细胞生长的抑制率：

细胞生长抑制率（%）=（1-OD样品组/OD对照组）×100%。

采用SigmaPolot 10.0软件计算对肿瘤细胞株的IC50值。

2 结果

2.1 对细菌的抑制作用

梅花状青霉FS83提取物对4种供试细菌的抑制效果，见表1。结果显示，发酵液提取物对枯草芽孢杆菌抑制效果最好，抑制圈直径达16.4 mm，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌也有一定的抑制效果，抑菌圈直径均为9.5 mm；菌丝体提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别为18.1 mm、17.3 mm，对铜绿假单胞菌也有一定的抑制作用，但抑菌圈不明显；两种提取物对大肠杆菌均没有抑制作用。

表1 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83提取物对细菌的抑制效果（n=3）

2.2 对细菌的最低抑制浓度

梅花状青霉FS83提取物对细菌的最低抑制浓度，见表2。两种提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果最好，最低抑制浓度均为1.56 μg/mL；菌丝体提取物对金黄色葡萄球菌也有很好抑制效果，最低抑制浓度为1.56 μg/mL。

2.3 对真菌的抑制作用

梅花状青霉FS83提取物对5种供试真菌的抑制效果，如表3所示。菌丝体提取物对绿色木霉、黑曲霉、黄曲霉、链格孢都有显著的抑制活性，抑菌率达70%以上；发酵液提取物对绿色木霉、黑曲霉、胶孢炭疽菌有一定抑制效果，抑制率均达50%以上。

表2 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83提取物对细菌的最低抑菌浓度（MICs）

表3 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83提取物对真菌的抑制作用

2.4 对真菌的最低抑制浓度

从表4可以看出，菌丝体提取物对绿色木霉的抑制效果最好，最低抑制浓度仅为0.78 mg/mL，对胶孢炭疽菌的最低抑制浓度最高，为3.12 mg/mL，对其他3种真菌的最低抑制浓度均为1.56 mg/mL；梅花状青霉FS83发酵液提取物对绿色木霉、黑曲霉具有较好的抑制活性，最低抑制浓度均为1.56 mg/mL。

表4 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83提取物对真菌的最低抑菌浓度（MICs）

2.5 对肿瘤细胞的抑制作用

梅花状青霉FS83提取物对3种肿瘤细胞株的抑制试验显示（表5），菌丝体提取物对NCI-H460、MCF-7、SF-268有较好的抑制作用，抑制率均达80%以上，而发酵液提取物仅对MCF-7有较好的细胞毒活性，抑制率为84.38%，对细胞株SF-268和NCI-H460的抑制作用则不明显。通过进一步测试，菌丝体提取物对3种肿瘤细胞株NCI-H460、MCF-7、SF-268的IC50值分别为55.8、62.5、63.5 μg/mL（表6）。

表5 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83提取物对3种肿瘤细胞株的抑制率（n=3）

3 讨论

海洋真菌活性成分的研究自20世纪80年代中期才开始有零星的报道，1986年，Schiehser等［9］从海洋真菌Leptosphaeria oraemaris中分离到第一个具有抗菌活性的天然产物Leptosphaerin，使人们认识到海洋真菌是寻找活性物质的重要资源，从中可以筛选到结构新颖、具有生物活性的代谢产物。王书锦等［10］从中国黄、渤海、辽宁近海地区分离得到海洋真菌508株，主要有青霉属（Penicillum）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）等，10%以上发酵产物具有抗细菌或抗真菌生物活性；徐宇航等［11］从厦门海域红树、海藻和海洋沉积物样品中分离得到24株具有抗肿瘤活性的菌株中，青霉属（Penicillum）真菌有9株，占全部活性菌株的37%。因此，青霉属真菌是发掘新的海洋活性物质的重要来源，近年来已从海洋青霉中发现了不少具有药用价值的活性代谢产物。如Gao等［12］从海藻内生真菌Penicillium chrysogenum中分离得到两个多聚氧化性类固醇化合物Penicisteroids A和B，其中Penicisteroids A具有很强的抗菌活性和选择性的细胞毒活性；Li等［13］从海洋青霉Penicillium terrestre中分离得到的含氯聚酮类化合物Chloctanspirones A对肿瘤细胞株HL-60和A-549具有明显的抑制活性，IC50分别为9.2和39.7 μmol/L；Zhuang等［14］从一株海洋青霉Penicillium sp. F11中分离得到新的聚酮类化合物Penicillone A对肿瘤细胞株HT1080和Cne2具有一定的抑制活性，IC50分别为45.8和46.2 μg/mL。

表6 梅花状青霉（Penicillium herquei）FS83菌丝体提取物对3种肿瘤细胞株的IC50值（n=3）

4 结论

本研究对海洋沉积物来源的梅花状青霉FS83提取物的抗菌、抗肿瘤活性进行研究发现，其发酵液提取物对枯草芽孢杆菌表现出明显的抗菌活性，对绿色木霉、黑曲霉、胶孢炭疽显示良好的抑制作用，抑菌率均达50 %以上，对肿瘤细胞MCF-7也有一定的细胞株毒活性；菌丝体提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用，对供试的5种真菌均表现出很好的抑制活性，对3种肿瘤细胞株也显示了明显的抑制作用。

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