甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定

徐文 许然 张利平

（河北大学生命科学学院 河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，保定 071002）

吡咯喹啉醌（PQQ）是一种阴离子水溶性醌类化合物，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶。PQQ于20世纪60年代被发现，1979年被Durine分离得到，随后Salishuryt通过X线衍射技术阐明这种化合物的结构并命名［1］。2004年Kay等［2］人利用电子顺磁共振法对绿脓假单胞菌所产生的乙醇脱氢酶辅基PQQ的原子结构进行了鉴定。PQQ有多种生理功能，它能够抑制过氧硝酸盐的表达，防止龋齿类动物中风 ，刺激神经生长因子生成、参与醌蛋白酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应力以及促进植物的生长［3-5］，使其在食品业、轻工业、农业和医药等方面具有重要的开发前景。目前PQQ造价昂贵，化学合成方法步骤繁杂，产率低，副产物多，污染严重，后续处理困难。而微生物发酵法以甲醇为唯一碳源，培养基以无机化合物为主，这有利于产品的提取，所需成本低，国外也有报道有人曾利用生丝微菌生产PQQ，所以发酵法生产PQQ在实际产业化中具有重要意义［6-8］。黏细菌是一类可滑行的革兰氏阴性杆菌，虎杖内生细菌多样性丰富，根据已有的报道，PQQ产生菌多为革兰氏阴性细菌［6］。本研究从160株虎杖内生细菌和黏细菌中共筛选到4株甲基利用型PQQ产生菌，编号分别为083114、083129、95001和95032，分别对其PQQ产量进行测定，对其同源性进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 虎杖内生细菌100株和黏细菌60株，均为本实验室分离获得并保藏。

1.1.2 培养基（1）完全培养基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0。（ 2）基本培养基：（NH4）2HPO43 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl l g/L，烟酸20 μg/L，VBl10 μg/L，VB220 μg/L，泛酸钙 20 μg/L，吡哆醇 20 μg/L，生物素10 μg/L，对氨基苯甲酸10 μg/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，FeS04·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L。（3）MPQ 培 养 基：MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO43 g/L，柠檬酸铁 30 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl2·4 H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 5 mg/L，CuSO4· 5H2O 0.5 mg/L。

1.1.3 主要仪器和试剂 HPLC为HITACHI L-2455； Thermo ODS反相C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；PQQ标准品系Sigma公司产品（>98.6），其他均为市售生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 PQQ产生菌的初筛 将供试菌株分别接种于装有10 mL 1%无水甲醇的完全培养基和1%无水甲醇的基本培养基的50 mL发酵管中，28℃、180 r/min摇床培养7 d，观察菌体生长情况，选择发酵液颜色由清澈变为红色的菌株。

1.2.2 发酵液中PQQ的提取 挑取初筛获得的菌株的单菌落，接入装有10 mL MPQ 培养基的发酵管中，28℃、180 r/min 振荡培养 72 h，然后将全部培养液倒入装有 50 mL MPQ 培养基的三角瓶中，28℃、180 r/min 振荡培养 7 d。

真空抽滤器抽滤去菌体，上清液中加入3倍体积的无水甲醇过夜，10 000 r/min 离心 20 min 取上清，pH调至3.5。

1.2.3 PQQ的光谱法分析 参照杨延新的方法［9］，将PQQ 产物分别加入石英和玻璃比色杯中进行紫外扫描，以MPQ培养基加入3倍体积甲醇液为对照，记录D326nm和D400nm值，计算OD326nm-OD400nm值用以检测PQQ含量。

1.2.4 PQQ的HPLC分析条件 流动相：甲醇∶水为80∶20；流速：0.5 mL/min；检测波长：213 nm；柱温：29℃；进样量：10 μL。

1.2.5 PQQ产生菌的鉴定 虎杖内生细菌培养36 h后进行革兰氏染色并观察菌体形态。黏细菌培养36 h后，于解剖镜观察子实体形态，每隔24 h观察一次。

菌株的16S rRNA基因序列测定参照文献［10］进行。使用细菌通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1525r（5'- AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'），PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物由北京三博生物技术公司测序。根据测序结果，使用MEGA软件（Version 5.05）及Neighbor joining（NJ）法构建系统发育进化树。

2 结果

2.1 PQQ产生菌的初筛

从160株供试菌株中初筛获得16株发酵后培养液变为红色的的菌株，其中虎杖内生细菌10株，其编号为083113、083114、083129、083142、083153、091417、091421、091423、091424和092610。黏细菌6株，其编号为95001、95011、95032、95041、95046和95047。

2.2 PQQ的光谱法分析

光谱学分析法通过计算OD326nm-OD400nm值用以检测PQQ含量，菌株091417和菌株091423的OD326nm-OD400nm为负值，说明此2株菌株不产生PQQ（表1），选择OD326nm-OD400nm值大于0的14株菌进行HPLC色谱分析。

2.3 PQQ的HPLC定量分析

通过HPLC分析，样品色谱峰的保留时间与标准品相同，通过色谱峰面积进行了定量分析（图1）。结果共筛选得到甲基利用型PQQ产生菌4株，编号分别为083114、083129、95001和95032，通过对色谱峰面积的定量分析其PQQ产量分别为64.340、3.344、4.427和8.342 mg/L。

2.4 PQQ产生菌的鉴定

2.4.1 形态学观察 菌株95001分离自福州圆柏树叶，其子实体在树叶基质上为球形，暗红色，表面干燥，无折光性。CAS液体发酵液中，菌体为圆球形，沿壁生长，产红棕色色素。

表1 16株供试菌株的光谱法分析测定结果

菌株95032分离自福州假苹婆树皮，其子实体在树皮基质上为椭球形，顶端尖，略带亮黄色，基部土黄色，发暗。CAS液体发酵液中，菌体呈絮状，沿壁生长，产黄色色素。

菌株083114革兰氏阳性，菌体细胞杆状，芽孢椭圆形，近末端，菌落透明，表面光滑透亮，边缘整齐。

菌株083129革兰氏阴性，短杆菌，不形成芽孢，菌落半透明，光滑湿润，圆形边缘整齐。

2.4.2 PQQ产生菌16S rRNA的系统发育分析 采用PCR技术扩增4株PQQ产生菌的16S rRNA基因序列，经北京三博远志生物技术有限公司测序。通过在GenBank中进行同源性序列搜索及比对，从中选取同源性较高菌株的16S rRNA基因序列构建系统进化树。结果（图2）显示083114为芽孢杆菌（Bacillus. sp），083129为无色杆菌（Achromobacter. sp），95001和95032均为黏球菌（Myxococcus. spp）。

3 讨论

本研究从160株供试菌株中筛选得到134株甲醇利用型菌和4株PQQ产生菌，其中菌株95032的PQQ产量为8.342 mg/L ，菌株083114的PQQ产量甚至高达64.34 mg/L，远远高出已报道的野生菌的PQQ产量，且这一结果是野生菌未经诱变选育且未进行发酵条件优化得到的。培养条件对PQQ的产量影响甚大，如某些微量元素和甲醇的含量等对PQQ生物合成具有显著影响［6］。可以预见，发酵条件经适当优化或对此两株菌进行遗传改造其PQQ产量也会相应提高。

已报道的可产生PQQ的微生物种属包括副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、甲烷单胞菌属（Methanomonas）、甲基芽孢杆菌属（Methylobacillus）、等［11］，国内外尚未见有关黏球菌属（Myxococcus）产生PQQ的报道。

根据以往的报道，PQQ高产菌株多为革兰氏阴性菌株，一般情况下，野生菌的PQQ产量多为2-3 mg/L［6］，而本研究筛选到的可产生64.34 mg/L PQQ的野生型菌株083114，与革兰氏阳性细菌酸快生芽孢杆菌的系统发育关系最近。菌株95032在发酵过程中多糖产量高达0.3 g/L，菌株95001的多糖甚至高达0.8 g/L，在发酵液离心过程中会有部分PQQ被多糖沉淀包裹而损失，这一特性阻碍了PQQ的提取和纯化及PQQ产量测定。可以推测，多糖被有效去除菌株95032和95001的PQQ产量会相应提高。

4 结论

从160株虎杖内生细菌和黏细菌中筛选到4株PQQ产生菌，分别属于芽孢杆菌、无色杆菌和黏球菌。其中芽孢杆菌083114的PQQ产量高达64.34 mg/L。

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