载脂蛋白E与脑梗死的关系

李爱丽 赵 欣 赵丽丽 韩英博 姚建华 王彦红 王思鉴

(吉林大学第二医院神经内科，吉林 长春 130041 )

随着饮食结构的变化和生活水平的提高，脑梗死的发病率呈越来越高、越来越年轻化趋势。脑梗死病因较多，除动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、心脏病、高血脂、吸烟及饮酒等因素外，有学者认为其发病可能与载脂蛋白E(ApoE)基因多态性有关。AopE是血脂的重要组成部分，其基因多态性与种族、地域、环境等因素有关。本文通过检测400例吉林省汉族脑梗死患者AopE的基因多态性以揭示其与脑梗死的关系。

1 对象与方法

1.1对象 研究组为2010年12月至2013年10月在吉林大学第二医院神经内科和长春市中医院神经内科住院的汉族脑梗死患者400例，其中男246例，女154例，平均年龄(60. 08±10. 25)岁；入选标准：符合1995年全国第4届脑血管病学术会议的诊断标准，且均经头部CT或MRI确诊，排除动脉炎、脂肪栓塞、药物、肿瘤等引起的脑梗死。对照组为同期在吉林大学第二医院体检中心健康体检者，随机抽取汉族100例，其中男57例，女43例，平均年龄(61.59±9.72)岁，入选标准：排除阿尔茨海默病、脑血管病、糖尿病、心脏病、肝肾疾病、血液疾病等。两组的年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1标本收集 抽取空腹患者及对照者肘静脉血10 ml，血中加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)抗凝，-20℃冰箱保存，待血液样本收集完成后统一测定。

1.2.2基因组DNA提取 采用血液基因组DNA提取盒从血液白细胞中提取DNA。

1.2.3PCR扩增 引物序列(由上海生工生物技术公司合成)为：P1(正义)：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′；P2(反义)：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。PCR反应体系：总体系20 μl，基因组DNA 2 μl，2倍缓冲液10 μl，DNA 聚合酶0.4 μl，正义及反义引物各6 pmol(1.2 μl)，无菌双蒸水6.4 μl。PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后95℃变性60 s、62℃退火45 s，最后72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃进一步延伸7 min。PCR 产物经含有EB的2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.4PCR产物酶切 总体积20 μl，PCR产物8 μl，HhaI内切酶1 μl，2倍缓冲液2 μl(大连宝生物公司)，无菌蒸馏水9 μl，混匀，37℃温浴2 h。反应终止后产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB溶液染色后观察结果。

1.3统计学处理 应用SPSS13.0软件进行分析。等位基因频数计算采用平均法。基因型和等位基因频率计算方法：基因型频率=基因型频数/总例数；等位基因频率=(纯合子基因型频率+杂合子基因型频率)/2。组间基因型及等位基因频率的比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1脑梗死组与对照组ApoE基因型的比较 脑梗死组ApoE 6种基因型的频率分别为：ε2/2 0.5%、ε3/3 67%、ε4/4 8%、ε2/3 6.5%、ε2/4 7.8%、ε3/4 10.2%；对照组为ε2/2 2%、ε3/3 79%、ε4/4 4%、ε2/3 7%、ε2/4 3%、ε3/4 5%。两组均以ε3/3基因型的频率最高，并且对照组明显高于脑梗死组(P<0.05)；脑梗死组以ε4/4及ε3/4基因型频率次之，但与对照组无差异(P>0.05)。

2.2脑梗死组与对照组等位基因的比较 脑梗死组ApoE 3种等位基因的频率分别为ε2 6%、ε3 75%和ε4 19%，对照组分别为ε2 7%、ε3 85%、和ε4 8%。两组中均以ε3等位基因频率最高，且对照组明显高于脑梗死组(P<0.05)，ε4等位基因频率次之，且脑梗死组也明显高于对照组(P<0.05)，ε2等位基因频率最低，两组间差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

ApoE是一种含有299个氨基酸结合有磷脂的单链多糖蛋白，其分子量为34 kDa，含有4个外显子及3个内含子，ApoE基因具有多态性，有3种等位基因ε2、ε3和ε4，因此人群中共有6种ApoE的基因型，即三种纯合子ε2/2 、ε3/3 、ε4/4，及三种杂合子ε3/2 、ε2/4 及ε3/4。其中最常见的基因型是ε3/3，最常见的等位基因为ε3，ε2及ε4较少。ε3被认为是“野生型”，ε2及ε4被认为是由ε3变异而来。ApoE参与机体血脂代谢及调节胆固醇平衡，在动脉硬化性疾病的发生、发展过程中起着重要的作用。本研究结果表明ε3/3基因型及ε3等位基因可能是脑梗死的保护因素，而ε4等位基因可能是脑梗死的危险因素，这与国内的一些学者研究一致。王秀娟等〔1〕研究认为ε3 等位基因具有保护作用，而ε4 等位基因可能是脑梗死的危险因素。姜长春等〔2〕研究发现脑梗死组ApoEε3/4基因型和ε4等位基因组较对照组升高，提示ε4等位基因是脑梗死的遗传易患因子，而ε3等位基因具有保护作用。张波等〔3〕研究认为ε3/3基因型、ε3等位基因可能是脑梗死的保护因素，ε4等位基因是脑梗死的危险因素。而对于ε3、ε4等位基因与脑梗死的关系研究结果也不一致，卢红艳等〔4〕研究认为ApoEε4 是动脉粥样硬化性血栓形成的遗传易感因子，未发现ε3等位基因对脑梗死的保护作用。周正艳等〔5〕研究发现脑梗死组ε3/4基因型、ε4等位基因频率明显高于对照组，认为ε4是黎族脑梗死的一种遗传易感因子；Jin等〔6〕研究亦认为ε4为脑梗死的遗传易感因子，未发现ε3等位基因的保护作用。赵志全等〔7〕研究认为ε3/4基因型可能是脑梗死病人脑动脉粥样硬化的危险因素，尚不能明确ε3、ε4等位基因与脑梗死的关系。有学者对转基因鼠缺血性脑梗死的研究发现，携ε4等位基因者较携ε3者病灶大，病情重〔8〕。对此有些可能的解释如下：(1)ε3等位基因有助于神经生长〔9〕；(2)ε3等位基因较ε4有更强的抗氧化作用〔10〕；(3)ε4等位基因能增加β-淀粉样蛋白在神经系统的沉积，进而影响神经元〔11〕。

关于ε2等位基因与脑梗死的关系有些学者研究不一致，Anuurad等〔12〕认为携带ε4和ε2 基因型的人群发生缺血性脑卒中事件的发病危险均呈上升变化。然而，王永卿等〔13〕研究认为ε2/ 2对脑梗死可能具有保护作用。Kokubo等〔14〕认为脑卒中与ApoE基因多态性的关系存在争议可能是脑卒中分类不明确和年龄的划分不同所致，研究认为ε2是血栓形成和心源性栓塞的危险因素，ε2与脑卒中的关系在>70岁的人中减弱，年龄和ApoE基因多态性可能均影响脑卒中的发生。

综上所述，人们对ApoE与脑梗死的关系越来越高度重视，研究结果的某些不一致，可能与研究样本的大小、种族、年龄及饮食习惯等因素有关，这有待于更大样本的临床研究证实。相信随着医学的发展这个问题将会更加明确，从而将有助于脑梗死的早期防治。

4 参考文献

1王秀娟，王 彦，王 静.保定市中老年人群载脂蛋白E基因多态性与脑梗死遗传易感性关系的研究〔J〕.中华临床医师杂志，2009；3(12)；2021-6.

2姜长春，孙洪英，和姬苓，等.脑血管病患者载脂蛋白E基因多态性分析〔J〕.中国卒中杂志，2008；3(3)：181-5.

3张 波，张卓伯，刘 洪，等.载脂蛋白E基因多态性与脑梗塞的关联研究〔J〕.华西医学，2006；21(1)；90-1.

4卢红艳，田桂玲，程 焱，等.3种类型脑梗死患者载脂蛋白E基因多态性分析〔J〕.天津医药，2008；36(10)：759-61.

5周正艳，符喜南，苏庆杰，等.海南黎族ApoE基因多态性与脑梗死的关系〔J〕.重庆医学，2009；38(22)：2822-4.

6Jin ZQ，Fan YS，Ding J，etal. Association of apolipop rotein E4 polymorphism with cerebral infarction in Chinese Han population〔J〕. Acta Pharmacol Sin，2004；25(3)：352-6.

7赵志全，穆俊霞，杨丰斌，等.载脂蛋白E基因多态性与脑梗死病人脑动脉粥样硬化关系的研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2011；9(2)：175-7.

8Sheng H，Laskowitz DT，Bennett E，etal. Apolipoprotein E isoform-Specific differences in outcome from focal ischemia in transgenic mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，1998；18(4)：361-6.

9Nathan BP，Bellosta S，Sanan DA，etal. Differential effects of apoli Poproteins E3 and E4 on neuronal growth in vitro〔J〕. Science，1994；264(5160)：850-2.

10Miyata M，Smith JD. Apolipoprotein E allele-specific antioxidant activity and effects on cytotoxcity by oxidative insults and beta-amyloid peptides〔J〕.Nat Genet，1996；14(1)：55-61.

11Thomas T，Thomas G，McLendon C，etal.β-Amyloid-mediated vasoact-ivuty and vascular endothelial damage〔J〕. Nature,1996；380(6570)：168-71.

12Anuurad E,Yamasaki M，Shaehetr N，etal.Apo E and ApoC-I polymorphisms：association of genotype with cardrovascular disease phenotype in African Americans〔J〕. J lipid Res Feb，2009；50(7)：1 472-8.

13王永卿，吴婵娟，姚 敏，等.黎族心脑血管疾病患者Apo E基因多态性分析〔J〕.检验医学，2012；27(4)：308-15.

14Kokubo Y，Chowdhury AH，Date C，etal. Age-dependent association of apolipoprotein E genotypes with stroke subtypes in a Japanese rural population〔J〕.Stroke,2009;31(6):1299-306.