miRNA对衰老调控的相关研究进展

宓 林 于晓峰 邹 健

(复旦大学附属华东医院消化内科，上海 200040)

衰老(aging)是每一个有机体都必须经历的复杂过程，随着时间的推移，众多器官功能逐渐衰退。即使是在组织中具有替换损伤细胞功能的干细胞(stem cells)，长时间暴露于有害的环境或内源性毒素中，也将导致细胞不断损伤或衰退。一旦替换与损失之间的平衡被打破，机体就会出现功能紊乱从而导致疾病的发生。随着衰老的进一步发展，机体内的慢性环境容易导致神经退行性变、糖尿病、骨关节退行性变及甚至肿瘤的发生。因此，深入认识并了解衰老机制将有助于削弱甚至攻克这一普遍存在的现象给人类带来的巨大影响。

1 研究背景

基因表达水平的改变决定生长发育中的组织分化，并与衰老中的机体器官、组织、细胞等功能下降有关。有机体的生长过程是被紧密调控的，而我们对生长发育与衰老之间的转变以及机体发育后改变的调控，同样都不甚了解。通过测定人和恒河猴生存期中额叶前皮质mRNA、miRNA及蛋白表达，发现仅少数基因表达的改变对衰老具有特异性，而衰老过程中多数miRNA和基因表达改变表现为发育模式的反转或延续。研究显示miRNA及转录因子调控了整个生存期中多数可调控进程的发育及发育后的表达改变。相应基因组区的差异性进化守恒提示这些调控进程对于发育而言也许是有利的，而对于衰老而言则可能是相对不利的。实验结果显示衰老过程中生长发育的调控及表达改变是有直接关系的〔1〕。与细胞增殖、静止、凋亡及分化等相类似，细胞的衰老是由特定的基因表达程序所紧密调控的。基因调控的衰老中含有重要的转录成分，包括p53、AP-1、E2F、Id及Ets在内的转录因子。近年来还发现了两组关于衰老的转录后调控的重要作用因子，第一组含与靶mRNAs相关的编码衰老的因子及影响细胞衰老的RNA结合蛋白(PBP)，如人抗原R(HuR)、AU结合因子(AUF1)、TTP。第二组含微小RNA(MicroRNA，miRNA)，这是一类广泛存在的非蛋白编码的小分子RNA，长度约为19-25nt，主要通过与靶mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或抑制蛋白质合成从而调控基因的表达。在细胞核内，miRNA的编码基因在RNA转录酶的作用下生成初级转录体pri-miRNA，然后pri-miRNA 在RNase III，Drosha的作用下，剪切为具有茎环结构的miRNA 前体(pre-miRNA)，接着由依赖Ran 和转运受体家族成员输出蛋白-5(Exportin-5)将pre-miRNA 从细胞核转运至胞质。pre-miRNA 在细胞质中由RNA 酶III(Dicer)进一步切割而产生成熟的miRNA。MiRNAs通过转录后水平调节基因的表达进而参与调控一系列的生命活动，包括细胞增殖、生长发育、器官形成、造血、凋亡、肿瘤的发生。现在人们越来越深刻地认识到miRNA对基因表达调控的有力作用，在识别衰老调控相关的miRNAs方面具有积极的作用。自2007年以来，全球掀起了一阵关于研究在衰老过程中具有差异表达的miRNAs的热潮，并进一步开展其在衰老表型方面作用的深入研究，证实miRNAs能通过多种途径影响特定的衰老过程。

2 MiRNAs在衰老中的主要作用机制

2.1MiRNAs与p53/p21衰老通路 P53在衰老及老化过程中起核心作用，其在控制衰老调控的miRNA表达中也具有一定影响。2007年有研究发现miR-34能触发结肠癌细胞及人二倍体成纤维细胞(HDFs)的衰老〔2,3〕。在复制衰老的纤维母细胞中，miR-34a的表达随着p53的改变而增多，miR-34家族可以从生长停滞及凋亡等方面影响p53的活性。目前有越来越多的经miR-34a作用而抑制的mRNAs已被识别，如编码E2F、c-Myc、SIRT1、Cdk4、Cdk6、Bcl-2、肝细胞生长因子受体(Met)及cyclins D1和E2的mRNAs，从而得出结论：miR-34a是一个已明确的抑癌因子并具有触发衰老的作用。MiR-34a在p53非依赖方式中呈现上调态势，在由Braf所触发的HDF衰老中miR-34a通过转录因子Elk1作用而上调，在粒细胞衰老过程中主要是经转录因子CCAAT增强结合蛋白(C/EBP)a作用而上调，在过氧化氢诱导的早衰过程中同样观察到miR-34水平的上调。MiR-34抑制肿瘤的作用与其启动衰老的机制是相一致的，过甲基化的miR-34a在许多不同肿瘤细胞类型中呈现出致癌性的改变，如肺癌、乳腺癌、结肠癌及肾癌〔4〕。提高miR-34a的水平不仅能够抑制肿瘤的发生，并且与SIRT1的表达下降以及可能导致动脉粥样硬化的抑制细胞增殖相关的内皮细胞衰老有关。在衰老的内皮祖细胞(EPCs)中miR-34a表达水平的升高能减少SIRT1的产物及EPC介导的血管生成。有研究分析了非人灵长类动物恒河猴大脑皮层神经元及大鼠原代培养神经元中特定miRNA分子- miR34a的表达特性及作用，发现其随着年龄梯度增长而呈现表达增加的规律：在过表达miR-34a的情况下，它可能通过抑制BCL-2而引起神经元的凋亡，提示miR-34a可能参与神经元的发育与衰老过程〔5〕。在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、动脉内皮细胞及人冠状动脉内皮细胞中，miR-217同样能降低SIRT1的表达，从而引起早衰和血管损伤的发生。最近发现miR-885-5p在神经母细胞瘤中的过表达可以触发细胞衰老，尽管其中CDK2及MCM5的mRNAs是直接作用靶点，但miR-885-5p能同时有力的激活p53通路并诱导p53调控基因〔6〕。

P21在应激及癌基因诱导的细胞衰老模型中是多个miRNAs的作用靶点。P21是广谱的cdk抑制因子，其表达受miRNAs中的miR-106家族及其他人乳腺上皮细胞中具有相似种子序列的如miR-130b,miR-302a-d,miR-512-3p及miR-515-3p所抑制。在该模型系统中，p21是诱导衰老过程所必须的，而降低p21的表达则可以从RasV12诱导的衰老过程中拯救细胞，衰老的HDFs及HTM细胞中高水平表达的p21可以降低miR-106b的水平。较少量的miR-15家族成员可以促进Bcl-2的积聚，与衰老细胞增强的抗凋亡能力相一致。

2.2MiRNAs调节p16/RB通路 另一组日渐受到关注的调控衰老的miRNA主要作用于细胞分裂周期，尤其是经RB通路。RB通路与p53通路是紧密相关的，其功能明显受cdk活性所控制。P16与p21相同，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)，p16是Cdk4及Cdk6的抑制因子，继而抑制pRb的磷酸化而维持其活性形式，在增殖所需的转录基因中阻断E2F。p16的翻译过程受HDFs中的miR-24所抑制。尽管增殖期的HDFs表达高水平的miR-24从而导致p16的低表达，晚期HDFs表达低水平的miR-24而产生高水平表达的p16，而单纯的miR-24异常过表达并不能阻止衰老的发展，同样，单纯的异常抗miR-24表达也并不能加速衰老发展，可能是因为miR-24同时也能降低许多增殖蛋白的表达。有研究显示E2F1负反馈回路下游的miR-449a及miR-449b能直接相互激活miR-449a/b的转录，从而定位并抑制CDK6及CDC25A，并进一步导致pRb过甲基化使细胞停滞于G1期〔7〕，MiR-24只有在和其他miRNAs(miR-15b,miR-25,miR-141)相联合的情况下才能起强化衰老的作用。而MiR-34能抑制cyclin D1及Cdk6的表达。

2.3MiRNAs与胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)通路 已明确IGF通路是调控信号通路，在蛋白质合成和血糖稳定中起重要作用。损伤IGF通路功能或引起其表达下降的突变能够延长C. elegans、果蝇、FIRCO鼠甚至人类的寿命。这些从低等生物体中实验得出的证据显示出miRNA在调节IGF通路中的重要性。Lin-4基因及其靶点lin-14共同调控C. elegans的寿命，由lin-14下降所引起的寿命延长需依赖2个转录因子：DAF-16和HSF-1。DAF-16是DAF-2下游的作用靶点，是C. elegans内一些胰岛素样多肽的一般受体，由此提示lin-4和lin-14参与调控IGF-1信号通路。一些研究报道有很多miRNAs共同参与调控IGF信号通路，尤其是miR-1可以与IGF-1的3'UTR部分结合而参与调控过程〔8,9〕。MiR-1在骨骼肌及心肌中呈特异性表达，并参与心脏的发育、心肌梗死、心脏干细胞分化及心律失常，并同时研究了其在心肌中的作用。与miR-1相同，miR-320和miR-206在心肌细胞中也能靶向结合IGF-1。MiR-145可以靶向结合1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)及胰岛素受体底物-1(IRS-1)，IRS-1是IGF-1R的对接蛋白。胰岛素样生长因子结合蛋白-5(IGFBP-5)是miR-140的直接靶点，通过p53依赖机制与细胞衰老相关联。而let-7a3与IGF2及IGFBP3蛋白水平反相关。脂代谢和胰岛素分泌也可分别被miR-122及miR-375所调控，IGF-1信号同样与SIRT1、白藜芦醇通路调控机体寿命相关，有趣的是miR-217在衰老的内皮细胞中的抑制可以通过增加SIRT1的活性而减少衰老细胞的比率。

2.4MiRNAs与TOR通路 TOR是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，虽然2种TOR蛋白(TOR1和TOR2)在酵母体内具有相似的控制细胞生长的功能，而哺乳动物体内的mTOR则有2个功能不同的复合物(TORC1和TORC2)。TORC1磷酸化S6K及4E-BP1从而促进翻译过程，而TORC2则控制细胞骨架的肌动蛋白。TOR通路集中作用于3方面控制细胞生长：分别为营养的有效性、能量状态及生长因子。TOR信号通路作为营养感受器与胰岛素/IGF信号通路相关联是合理的。由生长因子(胰岛素或IGF)触发后，信号转换至AKT/PKB(蛋白激酶B)从而抑制结节性硬化蛋白1/2(TSC1/TSC2)的功能，转而促进TORC1和TORC2的激活。在许多有机体中限制卡路里摄入可以延长寿命，由此进一步了解关于调控营养感受及生理反应的通路之间的复杂网络。TOR通路与胰岛素/IGF信号相互作用，功能缺失的猛禽突变C. elegans及TOR同源序列，daf-15、let-363的研究发现其与衰老相关，并能明显延长寿命〔10〕。TOR通路可能是由于其负性调控自体吞噬的作用而对延长寿命方面产生影响。有研究报道miR-100的过表达会抑制mTOR的mRNA及蛋白水平，但仍缺乏直接相关的证据〔11〕。MiR-21是由TOR和NFκB调控的，miR-30a靶向结合beclin-1并进而抑制自体吞噬，从而提示其可能与TOR通路具有相关性。

2.5MiRNAs调节SASP相关通路 SASP具有分泌多种生长因子、ECM降解酶及细胞因子的特点，后者中包括2种关键的炎症介质，IL-6和IL-8。有研究报道在HDFs中，miR-146a/b降低IL-1受体相关激酶1(IRAK1)的表达，IRAK1是IL-1信号转导通路的关键组成部分。通过IRAK阻断IL-6和IL-8的分泌而降低信号可以避开SASP〔12〕。长期培养的BJ纤维母细胞异常过表达端粒酶活性，且miR-146a的表达水平升高，提示SASP的调控可能与衰老有关〔13〕。整合蛋白β1是一种细胞表面蛋白，与ECM相互作用并影响HDF的衰老，miR-183在H2O2触发的衰老中能减少其表达。Let-7靶向结合蠕虫的细胞核受体DAF-12，DAF-12与脊椎动物的维生素D及肝X受体相关，DAF-12通过消除生殖细胞系的类固醇而介导寿命延长过程。在C. elegans中，类固醇信号也能调节D. melanogaster的寿命，其中类固醇是蜕化素，miR-14可与蜕化素受体靶向结合，提示其调节寿命的可能性。

3 小 结

离体培养的细胞中miRNAs对衰老的影响已逐步为人们所了解，而miRNAs在体内对于衰老及衰老调控的过程仍有待进一步探索。例如评估显示，肿瘤细胞中的miR-34a的水平在原发性黑色素瘤样本中，miR-34a的启动子CpG发生甲基化〔4〕，与黑色素瘤中miR-34a的较低转录相一致，提示p53能上调体内miR-34a的产物，更进一步支持miR-34a能在体内诱导衰老的观点，用于研究该过程的遗传模型最近得到一定的发展。MiRNA合成酶Dicer等位基因缺失的模型鼠表现出胚胎致死性，由此研究出一种Dicer条件缺失鼠，消除MEFs中的Dicer能触发生长停滞相关的早衰表型，上调Arf(通过阻断泛素介导的p53降解而使p53增多)，高表达的p53及p21能增加SAHF和SA-βgal的活性，当Dicer条件鼠与ARF/p16-null鼠或p53-null鼠杂交后，消除Dicer使生成的MEFs不发生衰老，提示损伤的miRNA的生物转化是通过Arf/p16和p53依赖通路从而启动衰老过程〔14〕，HDFs中下调的Dicer同样能诱导衰老的发生。

过去10年间人们对细胞衰老的触发、标志及影响有了一定的认识，并深刻了解到机体内的衰老是多种生理及病理过程的基础，不仅仅是在肿瘤方面，同时也表现在动脉粥样硬化、糖尿病、肌肉减少征、神经退行性变、心血管及呼吸系统疾病等多方面。MiR-22在老化心脏中表达上调，可能加速成心肌细胞衰老并增加其迁移活性，与心脏纤维化等增龄相关的心脏改变相关。研究发现软骨组织中miR-199a-3p、miR-193b的表达随衰老而呈现上调，而miR-320c则随老化而呈现下调，由此推测miR-199a-3p及miR-193b与软骨细胞的衰老相关，而miR-320c则与软骨细胞幼稚态相关〔15〕。在年轻的HUVECs中，miR-146a通过直接作用于NOX4蛋白而影响早熟老化样表型，从而与细胞衰老与老化相关联。通过比较人类、黑猩猩、恒河猴大脑皮层及小脑中增龄相关的miRNA表达水平差异，发现抑制miR-144表达会增加人体细胞中ATXN1水平〔16〕。在过去5年中证实了miRNAs是衰老过程的关键调控因素，在衰老的很多方面起到重要的作用，miRNAs能调节衰老相关的诸多重要过程。活化的P53能增加miR-34a的转录，miR-34和p21是很多衰老调控蛋白的抑制因子，许多miRNAs在减少p21及p16表达水平的同时也减少了衰老细胞的数量，而p21和p16的增多可以抑制cdks并激活RB。衰老细胞同时表现出转录及转录后因子水平的改变，其中有些能影响p53/p21及p16/RB衰老通路中的关键蛋白。以上三组蛋白共同作用时能够停止细胞周期的进程并明显改变衰老相关的基因表达程序。MiRNAs还能促进SASP而增加IL-6、IL-8的分泌，转而促进局部及整体的炎症反应，减少ECM的完整性。

近年来我国对miRNA在衰老中的作用也开展了一系列工作，研究发现使let-7a沉默可上调p66Shc蛋白表达水平，过表达let-7a则下调p66Shc蛋白表达水平，但无论let-7a的过表达或沉默均不影响P66Shc mRNA水平。let-7a对P66Shc翻译的调控机制在于前者可影响后者在多核糖体及p-body的分布水平。在人二倍体成纤维细胞(2BS细胞)衰老过程中，let-7a随细胞衰老而降低，P66Shc蛋白水平则随细胞衰老而升高。然而，细胞衰老过程中P66Shc mRNA水平并无明显改变，提示细胞衰老过程中P66Shc表达上调主要是转录后调控的结果。沉默P66Shc可延缓细胞衰老，延长细胞寿限(life-span)，过表达let-7a也可通过下调P66Shc其到类似效果。相反，沉默let-7a则上调P66Shc、加速细胞衰老、缩短细胞寿限〔17〕。MiR-107在细胞衰老中起着重要作用，可能是通过脂代谢异常途径导致细胞衰老〔18〕。统计发现作为细胞衰老调节的关键因子，许多miRNA与衰老及衰老相关的疾病有关，已有明确的证据表明在衰老过程中表达上调的miRNA有miR-138、miR-152、miR-410、miR-431和miR-493等，而表达下调的miRNA有miR-15A、miR-20A、miR-25和miR-155等〔19〕。

尽管目前对于miRNAs在衰老中对基因表达影响的认识逐渐深入，但对于衰老改变miRNA水平的机制仍所知甚少。目睹了体内衰老及miRNA控制衰老的相互作用后，一系列新挑战及新问题呈现在我们面前：MiRNAs如何在机体内影响衰老过程?哪些控制衰老的miRNAs在维持生理平衡状态中是必须的?哪些miRNA调节了异常衰老过程中的病理生理?这些miRNAs是如何在转录及转录后水平中被调控的？是否能通过增减miRNAs而调节衰老进程以达到治疗的目地?要回答这些问题必须从组织、器官及机体的层面充分了解体内衰老的过程，为达到该目标还必须识别普遍适用的，具有特异性且敏感度高的机体衰老细胞标记物。使用动物模型也有助于研究衰老细胞的细胞学、分子学、基因学及生化特性。衰老调控的miRNAs在动物模型体内已有了一定的了解，相比较而言在人体内的相关实验相对较少，就目前阶段而言要充分了解衰老miRNAs在生理相关情况下的影响尚有一定困难。更加全面地了解特异性miRNAs在衰老中的作用，同样能够使以miRNA为基础而干预衰老相关病理改变的治疗手段成为可能。MiRNAs是有力的分子工具及靶点，是在重建年龄相关的机体内稳态损伤中尤为显著。

4 参考文献

1Somel M.MicroRNA,mRNA,and protein expression link development and aging in human and macaque brain〔J〕.Genome Res,2010;20(9):1207-18.

2Tazawa H.Tumor-suppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci U.S.A,2007;104:15472-7.

3He L.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network〔J〕.Nature,2007;447:1130-4.

4Lodygin D.Inactivation of miR-34a by aberrant CpG methylation in multiple types of cancer〔J〕. Cell Cycle,2008;7,2591-600.

5Qi YT.The expression pattern and possible function of microRNA-34a in neurons〔J〕.Fen Zi Xi Bao Sheng Wu Xue Bao,2009;42(3-4):217-23.

6Afanasyeva EA,Mestdaqh P,Kumps C,etal.MicroRNA miR-885-5p targets CDK2 and MCM5,activates p53 and inhibits proliferation and survival〔J〕. Cell Death Differ,2011;18(6):974-84.

7Yang X,Feng M,Jiang X,etal.miR-449a and miR-449b are direct transcriptional targets of E2F1 and negatively regulate pRb-E2F1 activity through a feedback loop by targeting CDK6 and CDC25A〔J〕. Genes Dev,2009;23:2388-93.

8Elia L,Contu R,Quintavalle M,etal.Reciprocal regulation of miRNA-1 and insulin-like growth factor-1 signal transduction cascade in cardiac and skeletal muscle in physiological and pathological conditions〔J〕. Circulation,2009;120:2377-85.

9Yu XY,Song YH,Geng YJ,etal.Glucose induces apoptosis of cardiomyocytes via miRNA-1 and IGF-1〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2008; 376:548-52.

10Jia K,Chen D,Riddle DL.The TOR pathway interacts with the insulin signaling pathway to regulate C. elegans larval development,metabolism and life span〔J〕. Development,2004;131:3897-906.

11Nagaraja AK,Creighton CJ,Yu Z,etal.A link between mir-100 and FRAP1/mTOR in clear cell ovarian cancer〔J〕. Mol Endocrinol,2010;24:447-63.

12Bhaumik D.MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8〔J〕.Aging,2009;1:402-11.

13Bonifacio LN,Jarstfer MB. MiRNA profile associated with replicative senescence,extended cell culture,and ectopic telomerase expression in human foreskin fibroblasts〔J〕.PLoS ONE,2010;5:e12519.

14Mudhasani R.Loss of miRNA biogenesis induces p19Arfp53 signaling and senescence in primary cells〔J〕.J Cell Biol,2008;181:1055-63.

15Ukai T.MicroRNA-199a-3p,microRNA-193b,and microRNA-320c are correlated to aging and regulate human cartilage metabolism〔J〕.J Orthop Res,2012;30(12):1915-22.

16Persengiev S.Genome-wide analysis of miRNA expression reveals a potential role for miR-144 in brain aging and spinocerebellar ataxia pathogenesis〔J〕. Neurobiol Aging,2011;32(12):2316.e17-27.

17王文恭.MiRNA let-7通过p66Shc调节细胞衰老的机制〔C〕.沈阳:第二届全国抗衰老医学大会,2012:17.

18阮 杰,刘新光,熊兴东,等.MiR-107在细胞衰老作用中的初步研究〔C〕.沈阳:第二届全国抗衰老医学大会,2012:70.

19谭一虎,刘红朝,汪志宏.MiRNA可以作为衰老的生物学标志物吗〔C〕?沈阳:第二届全国抗衰老医学大会,2012:88-91.