中国主要葡萄酒产区酒酒球菌糖苷酶活性

乔 慧，卢 柯，杨世玲，薛楚然，刘树文,2,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 7 12100）

中国主要葡萄酒产区酒酒球菌糖苷酶活性

乔 慧1，卢 柯1，杨世玲1，薛楚然1，刘树文1,2,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 7 12100）

在苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）过程中，一些酒酒球菌产生的糖苷酶活性受葡萄酒环境的影响，筛选并利用在酿酒环境中具有高活力糖苷酶的菌株进行MLF，有助于提升葡萄酒的香气复杂性。本实验以中国5 个酿酒产区19 株酿酒特性优良的酒酒球菌和一株商业菌为实验菌株，通过测定5 种糖苷酶活性，对其中5 株糖苷酶活性高的菌株研究其在葡萄酒环境中糖苷酶的酶学性质。结果表明：20 株菌在相应底物作用下均含有可检测到的糖苷酶活力，不同菌株酶活性差异显著，地 区间差异不显著。5 株糖苷酶活性高的菌株最适pH值为4.0，最适温度为45 ℃，在低水平（4%乙醇+0.1 g/100 mL果糖）时有促进作用，高水平（1 4%乙醇+2 g/100 mL果糖）时抑制作用显著，葡萄糖则表现为抑制作用，但各种酶活性表现为菌株依赖性。在模拟酒条件下，菌株相对酶活力仅是菌株酶活力的9.805%～32.331%。总之，在所选菌株中，SD-1f在葡萄酒环境中的糖苷酶活性最高。

葡萄酒；酒酒球菌；糖苷酶活性

在葡萄酒酿酒体系中，有两类微生物发挥重要作用，即酵母菌和乳酸菌，其分别进行酒精发酵（alcohol fermentation，AF）和苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）。酿酒酵母可产多种酶，但糖苷酶并不是主要的酶，且在AF过程中，糖苷酶活性受葡萄糖的 显著抑制[1]。而一些非酿酒酵母具有大量的β-葡萄糖苷酶活力，但仅局限于AF开始阶段，随接种酿酒酵母的生长，非酿酒酵母的数量急剧下降[2]。因此，酵母菌对糖苷类香气的释放作用有限。

乳酸菌对葡萄酒中香气的形成具有重要影响，在MLF过程中可增加香气的复杂性，因为酒酒 球菌能够较好地适应葡萄酒中的低pH值和高酒精度等环境，在多数MLF过程中起主导作用[3]。研究表明，酒酒球菌可产糖苷酶，通过水解 葡萄糖苷（香气前体）释放香气物质，增加并改良葡萄汁和葡萄酒的花香和果香，并产生浓郁、自然的葡萄酒香气[4]。Guilloux-Benatier等[5]首次报道了关于酒酒球菌β-D-葡萄糖苷酶的研究，目前已经有大量相关研究[6-11]。Grimaldi等[12]在2000年首次提出多酶的存在，为了证实这一猜想，他们利用其他底物对22 株商业菌株的专一酶活性进行测定，证实酒酒球菌中存在葡萄糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和低含量的鼠李糖苷酶，尽管糖苷酶的种类是菌株依赖性的。

葡萄浆果中存在着游离态和结合态两类香气物质，游离态香气物质可以直接从葡萄酒中挥发出来，使人产生嗅觉反应；结合态香气物质没有香气，必须经过分解释放出游离态呈香物质才能产生香气[13]。通常，后者含量比前者要丰富得多。结合态香气物质由糖基和糖苷配基组成，糖基通常是β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖、β-D-木糖、β-芹菜糖、α-L-阿拉伯糖和α-L-鼠李糖[14]；糖苷配基包括单萜烯、C13-降异戊二烯、苯衍生物和脂肪族化合物，是对葡萄酒香气有贡献的物质[14-16]。其中萜烯类化合物是一些葡萄酒香气中最重要的组成部分，例如在麝香葡萄、琼瑶浆、雷司令和玛尔维萨葡萄酒中[12,17]。

葡萄酒中结合态香气前体可通过酸解、热水解或酶解释放出挥发性的糖苷配基[12,15]，其中酶解是一种更接近于自然、温和的方法，极具商业化应用前景，一般采用酶解的方法来增强葡萄酒香气[4,18]。糖苷酶对葡萄糖苷的水解，可一步反应，也可两步反应（顺序水解）。在顺序水解模式中，首先一种外切糖苷酶（α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-芹菜糖苷酶或β-D-木糖苷酶）切断糖内连接，释放出相应的糖和一个β-D-葡萄糖苷，随后β-D-葡萄糖苷酶催化β-D-葡萄糖苷的水解，释放出相应的糖苷配基和葡萄糖；在一步反应模式中，双葡萄糖苷酶催化糖苷配基与二糖苷之间的连接，从而释放出相应的糖苷配基和二糖[19]。α-D-葡萄糖苷酶可降解酵母菌衍生的大分子物质，为乳酸菌生长提供营养物质[5,16]。

综上所述，葡萄酒中的酒酒球菌可通过糖苷酶水解葡萄糖苷释放 香气物质，影响葡萄酒香气质量。尽管许多学者已经证明乳酸菌能够促进香气化合物释放，但关于参与反应的酶的种类的知识却相对较少[20]，且仅有少量菌株对多种底物有持续稳定的高活性。因此，研究各种酿酒参数和葡萄酒环境对糖苷酶活性的影响，可在菌株筛选时预测菌株在酿酒中发挥的作用以及它对葡萄酒香气特性的影响，减少乳酸菌对葡萄酒产生的负面影响，为生产优质葡萄酒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株来源于西北农林科技大学葡萄酒学院保存的中国5 个酿酒产区的优良酒酒球菌，包括山东7 株（SD-1a、SD-2a、SD-1b、SD-1g、SD-1f、SD-2gh、SD-2h）、新疆3 株（XJ-2a、XJ-2b、XJ-3a）、陕西2 株（SX-1b、SX-1a）、河北4 株（HB-1a、HB-1b、HB-1c、HB-2b）、宁夏3 株（NX-1e、NX-4b、NX-3g）和商业菌株1 株（31-DH）。

1.2 试剂

ATB培养基：蛋白胨 10 g、酵母浸粉 5 g、葡萄糖 10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、盐酸半胱氨酸 0.5 g、番茄汁体积分数25%，蒸馏水定容至 1 000 mL，pH值调至4.8，121 ℃灭菌20 min。

底物：对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p-nitro-phenyl β-D-glucopyranoside，pNP-βGlu）、对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（p-nitro-phenyl α-D-glucopyranoside，pNP-αGlu）、对硝基苯酚-β-D-木糖苷（p-nitro-phenyl β-D-xylopyranoside，pNP-βXyl）、对硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷（p-nitro-phenyl α-L-rhamnopyranoside，pNP-αRha）和对硝基苯酚-α-L-阿拉伯糖苷（p-nitro-phenyl α-L-arabinofuranoside，pNP-αAra）购买于美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；5417R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；MJ-250B恒温培养箱 上海跃进医用光学器械厂。

1.4 方法

1.4.1 菌株活化

酒酒球菌在ATB培养基26 ℃进行2 次连续活化培养，随后接种于ATB液体培养基上扩大培养。通过测定600 nm波长处的光密度（OD）值了解细菌的生长情况，当OD600nm接近1时，将培养液放置于4 ℃冰箱中过夜。

1.4.2 酒酒球菌糖苷酶活性测定

本实验改进了Grimaldi等[7,12]所用的酒酒球菌糖苷酶活性测定方法，反应总体积为80 μL，其中每个反应包括McIlvane缓冲液40 μL，菌悬液20 μL，底物溶液20 μL。

菌悬液制备：从ATB扩大培养基中吸取3 mL培养液，于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，收集菌体，用0.85 g/100 mL NaCl溶液重悬，重复2 次操作，最后使菌体密度OD600nm≈0.5，并测定菌密度OD600nm值。

McIlvane缓冲液制备：由0.1 mol/L柠檬酸和0.2 mol/L磷酸氢二钾配制而成，缓冲液浓度为0.2 mol/L，pH值为4.0。

底物溶液制备：分别配制对硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNP-βGlu）10 mmol/L、对硝基苯基α-D-葡萄糖苷（pNP-αGlu）10 mmol/L、对硝基苯基β-D-木糖苷（pNP-βXyl）7.5 mmol/L、对硝基苯基α-L-鼠李糖苷（pNP-αRha）7.5 mmo/L、对硝基苯基α-L-阿拉伯糖苷（pNP-αAra）7.5 mmol/L。

反应体系混合均匀，于37 ℃条件下反应1 h，随后立即加入160 μL的Na2CO3（0.5 mmol/L）终止反应并显色，放置至室温，2 500 r/min离心18 min ，吸取200 μL上清液至另一离心管中。在400 nm波长处用UV-2450紫外分光光度计测定上清液的OD值，重复3 次。空白为McIlvane缓冲液替代菌悬液的反应体系，其他处理相同。

酶活力单位定义：以各种糖苷酶对应的糖苷为特异性底物，1 min内每1 g/L菌体细胞水解相应底物生成1 μmol/L对硝基苯酚（pNP）定义为一个酶活力单位（U）。

1.4.3 糖苷酶酶学性质研究

1.4.3.1 pH值对糖苷酶活性的影响

用1 mol/L HCl或NaOH调节McIlvane缓冲液，设定pH值梯度为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在上述反应条件下测定酶活力。

1.4.3.2 温度对糖苷酶活性的影响

通过恒温水浴锅设定温度梯度，分别设为 15、25、35、45、55 ℃，在上述反应条件下测定酶活力。

1.4.3.3 乙醇、葡萄糖和果糖对糖苷酶活性的影响

分别设定乙醇体积分数（4%、8%、12%、14%）、葡萄糖质量浓度（0.1、0.4、0.75、2 g/100 mL）和果糖质量浓度（0.1、0.4、0.75、2 g/100 mL），在上述反应条件下测定酶活力，对照为未加乙醇、葡萄糖和果糖所测的酶活力，即菌株糖苷酶活性测定中所测得的酶活力，设定其相对酶活力为100%。

1.4.3.4 模拟酒对糖苷酶活性的影响

模拟酒配方为[16]：酒精度11%、葡萄糖 2 g/L、果糖 2 g/L、pH 3.5，20 ℃反应1 h后测定酶活力，对照为菌株糖苷酶活性测定中所测得的酶活力，设定其相对酶活力为100%。

2 结果与分析

2.1 酒酒球菌的糖苷酶活性

由表1可知，2 0 株酒酒球菌在5 类糖苷酶相应糖苷底物作用下，都有可检测 到的糖苷酶活力（0.815～50.3 45 μmol/（g·min））。β-D-葡萄糖苷酶的平均酶活力为6.197 μmol/（g·min），菌株 间差异显著，最高酶活力（NX-3g）是最低酶活力的3 倍，其中商业菌株31-DH的酶活力为7.733 μmol/（g·min），在所测菌株中酶活性相对较高。对于α-D-葡萄糖苷酶活性，平均酶活力为39.126 μmol/（g·min），是β-D-葡萄糖苷酶的6 倍，且最高酶活力是β-D-葡萄糖苷酶最高酶活力的5 倍，菌株间的差异显著。此外，这两种酶活性没有直接联系，例如XJ-1a、XJ-3a两种酶活性都很低，而一些菌株具有较高的β-D-葡萄糖苷酶、较低的α-D-葡萄糖苷酶活性（NX-3g、SX-1a），其他菌株也有相反的情况（SD-1g、SD-2a）。对其他3 种糖苷酶的测定也可以得出：β-D-木糖苷酶的平均酶活力是β-D-葡萄糖苷酶活性的2 倍，α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的活性都较小，但所有菌株都可以检测得到。由此可以推测，5 类糖苷酶活性的总体趋势为：α-D-葡萄糖苷酶＞β-D-木糖苷酶＞β-D-葡萄糖苷酶＞α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。

表1 酒酒球菌糖苷酶活性Table1 Glycosidase activities of Oenococcus oeni

同时通过对地区间的差异显著性分析，可以得出对底物pNP-βGlu、pNP-αGlu、pNP-βXyl、pNP-αAra和pNP-αRha地区间差异显著性分别为0.293、0.109、0.117、0.109和0.874，差异不显著（P＞0.05）。因此 地区不能作为区分菌株糖苷酶活性高低的依据。

众所周知酒酒球菌处于葡萄酒恶劣、复杂的环境中，如低pH值、低温、高乙醇体积分数及葡萄糖和果糖等因素都可能对糖苷酶的活性产生影响，因此有必要对菌株在单因素条件下糖苷酶活性的变化进行研究。本实验中以β-D-葡萄糖苷酶和α-D-葡萄糖苷酶为依据，根据表1测定结果，选取酶活性高的5 株菌（NX-3g、SX-1a、SD-1f、HB-1c、31-DH），研究各因素对酶活性的影响。

2.2 pH值对糖苷酶活性的影响

图1 pH值对酒酒球菌糖苷酶活性的影响Fig.1 Effect of pH on glycosidase activities of Oenococcus oeni

葡萄酒的pH值是影响酒酒球菌生存与生长最重要的因素之一，同样也会影响到糖苷酶的活性。由图1可知，从总体上来看，pH值对5 株酒酒球菌糖苷酶活性有显著影响。对β-D-葡萄糖苷酶，菌株在pH 4.0时酶活性最高，最高酶活力是最低酶活力的7 倍。对α-D-葡萄糖苷酶，在pH 2.5时，酶活性几乎为零；随pH值升高，抑制作用减弱，在pH 4.0时达最大；大于pH 4.0时，酶活性缓慢下降。对其他3 种酶可以看出：在pH 4.0和5.5有两个峰值，在小于pH 4.0时，菌株糖苷酶活性受到显著抑制。因为葡萄果实中含有大量的与鼠李糖连接的香气物质，鼠李糖苷酶在酿酒过程中发挥重要作用[21]，但从图中可以看出，其对底物的水解作用较弱，最高酶活力仅为5.419 μmol/（g·min）。就这一参数而言，各酶活性是菌株依赖性的。葡萄酒的pH值通常为3.0～4.0，在此pH值时糖苷酶活性受抑制，只有低含量的酶活性。

2.3 温度对糖苷酶活性的影响

图2 温度对酒酒球菌SX-1a（A）和SD-1f（B）糖苷酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on glycosidase activities of Oenococcus oeni

考虑到酿酒过程中温度通常是在10～30 ℃，因此测定了温度对糖苷酶活性的影响。虽然不同菌株的酶活性不同，但是随温度变化的总体趋势基本一致，所以选择2 株菌SX-1a和SD-1f为代表，测定结果见图2，5 种酶的最适温度都在45 ℃左右，在温度小于最适温度时，随温度升高酶活性相应增加，随着温度接近55 ℃所有糖苷酶活性迅速下降。MLF过程温度通常控制在20～23 ℃，在此温度下2 株菌只有较低的酶活性。

2.4 乙醇、葡萄糖和果糖对糖苷酶活性的影响

乙醇和糖（包括葡萄糖、果糖）通常被认为对糖苷酶活性有抑制作用[15,22]。因此，本实验测定了这些物质对糖苷酶的影响，结果见图3。

葡萄酒中乙醇体积分数通常小于15%，大量的研究已经证明乙醇对糖苷酶活性的影响取决于菌株和乙醇体积分数[7,22]。目前有2 种乙醇对糖苷酶活性影响的机制，一种认为乙醇作为一种关键糖基中间物，当它的体积分数增加时，可以增加此酶的糖基转移酶的反应速率；另一种解释认为乙醇可能改变膜通透性，促进细胞内酶和底物的接触[22]，酶活性下降可能由酶变性失活引起[15]。由图3可知，在4%乙醇体积分数时，SD-1f的β-D-葡萄糖苷酶的相对酶活力为112%，高于对照，其他菌株都低于对照，说明菌株对乙醇的耐受性是菌株依赖性的，随着乙醇体积分数升高，酶活性迅速下降；所有菌株α-D-葡萄糖苷酶在设定乙醇体积分数下都受到抑制；低体积分数（4%和8%）可促进β-D-木糖苷酶活性；所有菌株α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶在测定浓度条件下也受到抑制，后者受抑制程度更显著，SX-1a在体积分数14%抑制程度大于95%。就这一参数而言，可以推断SD-1f在葡萄酒乙醇体积分数12%和14%条件下菌株酶活性保持最高。

图3 乙醇、葡萄糖和果糖对酒酒球菌糖苷酶活性的影响Fig.3 Effects of alcohol, glucose and fructose on glycosidase activities of Oenococcus oeni

大量研究已经证明葡萄糖和果糖会降低多 种来源菌株的糖苷酶活性[6,23]。葡萄糖即使在最低测定质量浓度0.1 g/100 mL时，5 种糖苷酶活性都受到不同程度的抑制，β-D-葡萄糖苷酶活力下降幅度为12%～40%，α-D-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活力仅是对照的50%。与本实验测定结果一致，Williams等[24]证明葡萄酒中葡萄糖质量浓度即使小于0.40 g/100 mL仍对糖苷酶活性有抑制作用。随葡萄糖质量浓度增加，酶活性抑制作用增强，但不呈线性关系，其中α-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶下降不显著，其他3 种酶活性受抑制显著。从总体来看，SD-1f受影响最小，NX-3g受影响最大。

与葡萄糖类似，果糖的典型反应也是抑制，尽管从总体来看降幅小于葡萄糖，但不同菌株受果糖的影响也不同。对菌株31-DH和NX-3g，即使在最低质量浓度（0.1 g/100 mL），β-D-葡萄糖苷酶活性也受到抑制，而菌株SX-1a和SD-1f酶活性增强。在测定质量浓度下，所有菌株的α-D-葡萄糖苷酶活性都受到显著抑制，仅是对照的50%，但随质量浓度增加活性减小程度不显著。对β-D-木糖苷酶，菌株SD-1f表现最为突出，基本上不受果糖的影响，其他菌株都受果糖的抑制，降幅小于α-D-葡萄糖苷酶。α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶在低质量浓度（0.10 g/100 mL和0.40 g/100 mL）时，一些菌株表现为促进作用，随果糖质量浓度升高至2.00 g/100 mL时，最高酶活力分别仅是对照的44%和46%。

2.5 模拟酒对糖苷酶活性的影响

在大部分情况下，葡萄酒中酒酒球菌通常都处于上述各因素的综合作用下。为了研究这些参数的综合作用，测定了在模拟酒环境中菌株的糖苷酶活性，结果见表2，菌株的相对酶活力仅是菌株酶活力的9.805%～32.331%，从总体来看，菌株SD-1 f受模拟酒环境条件影响最小，与单因素测定结果一致，β-D-葡萄糖苷酶活力为2.422 μmol/（g·min），是对照的31.046%。与本实验测定结果类似的，Grimaldi等[7,22]报道多种酿酒参数（pH值、乙醇、糖和温度）共 同作用会增强对糖苷酶的抑制作用，同时，不同菌株对参数的反应也不同。

表2 模拟酒环境对酒酒球菌糖苷酶活性的影响Table2 Effect of model wine environment on glycosidase activities of Oenococcus oeni

3 结 论

本研究证明酒酒球菌不仅普遍产糖苷酶，而且糖苷酶种类不局限于β-D-葡萄糖苷酶。20 株酒酒球菌在5 类糖苷酶相应糖苷底物作用下，都有可检测到的糖苷酶活力，且5 类糖苷酶活性的总体趋势为：α-D-葡萄糖苷酶＞β-D-木糖苷酶＞β-D-葡萄糖苷酶＞α-L-阿拉伯糖苷酶≥α-L-鼠李糖苷酶。α-D-葡萄糖苷酶活性最高，为乳酸菌生长提供营养物质，促进生长；β-D-葡萄糖苷酶是提升葡萄酒香气的关键酶，在筛选菌株时应优先考虑；α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶活性很低，而葡萄果实中却含有较多的与鼠李糖连接的二糖类化合物，抑制了香气的释放。地区间差异分析结果为不显著，不能作为区分菌株糖苷酶活性的依据。

通过对潜在的抑制参数pH值、温度和葡萄酒组分（乙醇、葡萄糖和果糖）对5 种糖苷酶活性影响的研究表明，影响作用介于轻微促进和强烈抑制之间。5 种糖苷酶在pH 4.0都有一个峰值，在葡萄酒的pH值范围内，只有较低的活性；糖苷酶最适温度都在45 ℃左右；乙醇和果糖在低水平（4%，0.1 g/100 mL）时有促进作用，高水平（14%，2.00 g/100 mL）时抑制作用显著，葡萄糖则表现为抑制作用，但各种酶活性表现为菌株依赖性。通过测定模拟酒条件下菌株的糖苷酶活性，有助于了解工业生产中酶的潜在活性。从本实验研究结果看，SD-1f在葡萄酒环境中糖苷酶活性最高。

总之，只有少数酒酒球菌对测定的底物表现出持续高活性，而葡萄酒的组成成分相当复杂，在实际生产中菌株酶活性受环境的综合影响更大，所以在菌株筛选时需要慎重考虑菌株在葡萄酒环境中的生长状况和它对葡萄酒糖苷修饰方面的应用，同时也突出了在后续工作中进行糖苷酶纯化接种发酵的重要性。

[1] BARTOWSKY E, HENSCHKE P, PRETORIUS I. Chasing wine aroma: does Oenococcus oeni have the potential to release aroma compounds from authentic grape precursors[J]. Wine Industry Journal, 2004, 19(2): 24-31.

[2] SWANGKEAW J, VICHITPHAN S, BUTZKE C E, et al. Characterization of β-glucosidases from Hanseniaspora sp. and Pichia anomala with potentially aroma-enhancing capabilities in juice and wine[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 27(2): 423-430.

[3] 李华. 葡萄酒工艺学[M]. 北京: 科学出版社, 2007: 94-121.

[4] GUEGUEN Y, CHEMARDIN P, JANBON G, et al. A very efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(8): 2336-2340.

[5] GUILLOUX-BENATIER M, SON H S, BOUHIER M F. Activités enzymatiques: glycosidases et peptidases chez Leuconostoc oenos a u cours de la croissance bactérienne. Influence des macromolécules des levures[J]. Vitis, 1993, 32: 51-57.

[6] MESAS J M, RODRIGUEZ M C, ALEGRE M T. Basic characterization and partial purification of beta-glu cosidase from cell-free extracts of Oenococcus oeni ST81[J]. Letters in Applied Microbiology, 2012, 55(3): 247-255.

[7] GRIMALDI A, BARTOWSKY E, JIRANEK V. A survey of glycosidase activities of commercial wine strains of Oenococcus oeni[J]. International Journal of F ood Microbiology, 2005, 105(2): 233-244.

[8] BOIDO E, LLORE T A, MEDINA K, et al. Effect of beta-glycosidase activity of Oenococcus oeni on the glycosylated flavor precursors of Tannat wine during malolactic fermentation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50: 2344-2 349.

[9] UGLIANO M, GENOVESE A, MOIO L. Hydrolysis of wine aroma precursors during malolactic fermentation with four commercial starter cultures of Oenococcus oeni[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(17): 5073-5 078.

[10] D’INCECCO N, BARTOWSKY E, KASSARA S, et al. Release of glycosidically bound flavour compounds of chardonnay by Oenococcus oeni during malolactic fermentation[J]. Food Microbiology, 2004, 21(3): 257-265.

[11] MCMAHON H, ZOECKLEIN B W, FUGELSANG K, et al. Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 1999, 23: 198-203.

[12] GRIMALDI A, BARTOWSKY E, JIRANEK V. Screening of Lactobacillus spp. and Pediococcus spp. for glycosidase activities that are important in oenology[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(5): 1061-1069.

[13] PEREZ-MARTIN F, SESENA S, IZQUIERDO P M, et al. Screening for glycosidase activities of lactic acid bacteria as a biotechnological tool in oenology[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(4): 1423-1432.

[14] GAGNE S, LUCAS P M, PERELLO M C, et al. Variety and variability of glycosidase activities in an Oenococcus oeni strain collection tested with synthetic and natural substrates[J]. Journal of Applied Microbiology, 2011, 110(1): 218-228.

[15] BARBAGALLO R N, SPAGNA G, PALMERI R, et al. Assessment of β-glucosidase activity in selected wild strains of Oenococcus oeni for malolactic fermentation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34(3/4): 292-296.

[16] HERNANDEZ-ORTE P, CERSOSIMO M, LOSCOS N, et al. Aroma development from non-floral grape precursors by wine lactic acid bacteria[J]. Food Research International, 2009, 42(7): 773-781.

[17] MATE O J J, JIMNEZ M. Monoterpenes in grape juice and wines[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(1): 557-567.

[18] CASTRO VÁZQUEZ L, PÉREZ-COELLO M S, CABEZUDO M D. Effects of enzyme treatment and skin extraction on varietal volatiles in Spanish wines made from Chardonnay, Muscat, Airén, and Macabeo grapes[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 458(1): 39-44.

[19] GUNATA Z Y, BITTEUR S, BRILLOUET J M, et al. Sequential enzymic hydrolysis of potentially aromatic glycosides fr om grape[J]. Carbohydrate Research, 1988, 184: 139-149.

[20] MICHLMAYR H, SCHUMANN C, da SILVA N M, et al. Isolation and basic characterization of a beta-glucosidase from a strain of Lactobacillus brevis isolated from a malolactic starter culture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(2): 550-559.

[21] VOIRIN S G, BAUMES R L, SAPIS J C, et al. Analytical methods for monoterpene glycosides in grape and wine: Ⅱ. Qualitative and quantitative determination of monoterpene glycosides in grape[J]. Journal of Chromatograph y A, 1992, 595(1): 269-281.

[22] GRIMALDI A, MCLEAN H, JIRANEK V. Identification and partial characterization of glycosidic activities of commercial strains of the lactic acid bacterium, Oenococcus oeni[J]. American Society for Enology and Vi ticulture, 2000, 51(4): 362-369.

[23] MICHLMAYR H, EDER R, KULBE K D, et al. β-Glycosidase activities of Oenococcus oeni: current state of research and future challenges[J]. Mitteilungen Klosterneuburg, 2012, 62: 87-96.

[24] WILLIAMS P J, SEFTON M A, MARINOS V A. Hydrolytic flavor release from non-volatile precursors in fruits, wines and some other plant-derived foods[J]// HOPP R, MORI K. Recent developments in flavor an d fragrance chemistry. 1993, 52(1): 283-290.

Glycosidase Activities of Oenococcus oeni from Major Wine-Producing Regions in China

QIAO Hui1, LU Ke1, YANG Shi-ling1, XUE Chu-ran1, LIU Shu-wen1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

The wine-related lactic acid bacteria, especially Oenococcus oeni, can produce glycosidase and release volatile aroma compounds through hydrolysis of grape-deriv ed aroma precursors by undertaking malolactic fermentation (MLF), thus improving the aroma complexity of the wine. To investigate five glycosidase activities, 19 strains of O. oeni from five wine-producing regions in China and a commercial strain were selected, and then five strains with higher glycosidase activities were used to explore glycosidase properties in model wine environment. The results showed that all these 20 strains produced detectable glycosidase activities towards the corresponding substrates. Significant differences were observed among different strains, while no difference was observed among different wine regions. The optimum pH was 4.0 and optimum temperature was 45 ℃ for glycosidase. Ethanol and fructose could stimulate at lower concentrations (4% ethanol + 0.1 g/100 mL fructose) but significantly inhibit at higher concentrations (14% ethanol + 2 g/100 mL fructose) glycosidase activity, which, however, was inhibited by glu cose at all investigated concentrations. Furthermore, the responses of the enzyme activities were strain-dependent. In the model wine environment, only 9.805%-32.331% of glycosidase activity remained. In conclusion, SD-1f displayed the highest glycosidase activity among all selected strains.

wine; Oenococcus oeni; glycosidase activity

Q93-3

A

1002-6630（2014）23-0144-07

10.7506/spkx1002-6630-201423029

2013-11-20

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD31B07）； 中央高校基本科研业务费专项资金项目（2109021104）；国家现代农业（葡萄）产业技术体系建设专项（nycytx-30-ch-03）

乔慧（1987—），女，硕士研究生，研究方向为酿酒微生物。E-mail：qiaohui9163@163.com

*通信作者：刘树文（1965—），男，教授，博士，研究方向为葡萄酿酒微生物。E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn