人参二醇对鱼藤酮 MPP+诱导的BV2细胞活性下降的作用

金晓蓉 孙馨 林筱洁 苗青 高瑞兰 方桂伦

·基础研究·

人参二醇对鱼藤酮 MPP+诱导的BV2细胞活性下降的作用

金晓蓉 孙馨 林筱洁 苗青 高瑞兰 方桂伦

目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的小鼠小胶质细胞活性下降的影响。方法以小鼠BV2细胞为研究对象，以鱼藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）或MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）处理24h和诱导细胞活性下降。设阴性对照组、人参二醇对照组（100 mg/L），鱼藤酮（0.1μmol/L）或MPP+（100μmol/L）损伤组，人参二醇治疗组（10、25、50、75、100mg/L）。采用MTT法检测细胞活性。结果各浓度人参二醇对BV2细胞的活性无明显影响。鱼藤酮或MPP+处理24h可诱导BV2细胞活性下降，各浓度人参二醇不能逆转鱼藤酮或MPP+造成的细胞活性下降。结论人参二醇对鱼藤酮或MPP+诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。

人参二醇 鱼藤酮 MPP+ 小鼠 BV2细胞

帕金森病（parkinson’s disease PD）是一种常见的中老年退行性神经系统疾病。目前临床主要是多巴胺（dopamine DA）替代治疗，该疗法不能阻止DA能神经元继续变性和凋亡，而且副作用大。因此很有必要从中药中寻找安全有效的神经元保护剂。

本课题组以往研究证实人参二醇组皂苷（panoxadiol，GPD）是人参总皂苷中的有效成分，人参二醇对神经系统具有一定的保护作用。作者自2008年1月至2010年6月以鱼藤酮、MPP+诱导小鼠小胶质细胞株BV2细胞活性下降，观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导BV2细胞活性下降的影响，为治疗帕金森病提供安全有效的中药新药。

1 材料与方法

1.1 细胞株 BV2细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，用含10%灭活胎牛血清（购自杭州四季青生物技术有限公司）的高糖DMEM（购自HyClone公司）培养（全培养液），2～3d传代，相近代数的细胞用于实验。

1.2 主要试剂 人参二醇（由浙江省中医院提供）；二苯基四氮唑溴盐（MTT）、鱼藤酮、MPP+、胰酶购自美国Sigma公司。

1.3 药物处理 （1）鱼藤酮处理［1，2］：细胞接种于96孔板，贴壁生长24h后换液（人参二醇处理组加含人参二醇的全培养液，对照组换全培养液），然后加入含不同浓度鱼藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）的全培养液，对照组换用全培养液后继续培养24h。实验分12组，分别为：阴性对照组；鱼藤酮（0.1μmol/L）模型组；鱼藤酮 加10、25、50、75、100mg/L人参二醇；人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）对照组。人参二醇在鱼藤酮给药前24h加药，并在鱼藤酮处理全过程持续给药。（2）MPP+处理［1，3］：细胞接种于96孔板，贴壁生长24h后换液（人参二醇处理组加含人参二醇的全培养液，对照组换全培养液），然后加入含不同浓度MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）的全培养液，对照组换用全培养液后继续培养24h。实验分12组，分别为：阴性对照组；MPP+（100μmol/ L）模型组；MPP+ 加10、25、50、75、100 mg/L人参二醇；人参二醇（10、25、50、75、100 mg/L）对照组。人参二醇在MPP+给药前24h加药，并在MPP+处理全过程持续给药。

1.4 MTT测定细胞活性［4］药物处理完毕后，吸弃96孔板中培养液，每孔加入10μlMTT（5mg/ml，配制于PBS），置于37℃，5% CO2培养箱继续孵育2h后，弃去培养液，每孔加入100 μl二甲亚砜（DMSO），振荡10min，待结晶完全溶解后，在酶标仪测定570nm处吸光值（OD570），损伤组和药物处理组吸光值与阴性对照组吸光值的百分比，计算存活细胞百分率。

1.5 统计学处理 采用Prism 4 for windows（Graph Pad Software Inc.，USA）统计软件。计量资料用（x±s）表示。各组间方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，若多组间存在显著性差异，随后的两两比较采用Dunnett’s法；各组间方差不齐时，多组间比较采用Kruskal-Wallis法（非参数单因素方差分析），若多组间存在显著性差异，随后的两两比较采用Dunns法。

2 结果

2.1 鱼藤酮对BV2细胞活性的影响 MTT结果提示，鱼藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）孵育BV2细胞24h后，细胞的活性随鱼藤酮浓度的升高而下降（P＜0.01），经预实验选择，采用鱼藤酮0.1μmol/L处理BV2细胞24h作为损伤条件，见表1，图1。

表1 鱼藤酮对BV2细胞活性的影响（x±s）

图1 鱼藤酮对BV2细胞形态的影响

2.2 人参二醇对鱼藤酮处理后BV2细胞活性的影响 与对照组比较，鱼藤酮0.1μmol/L处理BV2细胞24h后，细胞活性明显降低（P＜0.01），人参二醇不能促进细胞增殖，也不能逆转鱼藤酮诱导的细胞活性下降，表2。

表2 人参二醇对鱼藤酮处理后BV2细胞活性的影响（x±s）

2.3 MPP+ 对BV2细胞活性的影响 MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）孵育BV2细胞24h后MTT试验表明，细胞的活性随MPP+浓度的升高而下降（P＜0.01），经预实验选择，采用MPP+ 100μmol/L处理BV2细胞24h作为损伤条件，见表3，图2。

表3 MPP+对BV2细胞活性的影响（x±s）

图2 MPP+对BV2细胞形态的影响

2.4 人参二醇对MPP+处理后BV2细胞活性的影响 与阴性对照相比，MPP+100μmol/L处理BV2细胞24h后，细胞活性明显降低（P＜0.01），人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）不能促进细胞增殖，也不能逆转MPP+诱导的细胞MTT染色吸光度下降，见表4。

表4 人参二醇对MPP+处理后BV2细胞活性的影响

表4 人参二醇对MPP+处理后BV2细胞活性的影响

注：与阴性对照组比较*P＜ 0.01。

处理浓度nOD570细胞活性（%）阴性对照62.357±0.176100.0±7.46 MPP+对照（100μmol/L）61.776±0.117*75.34±4.95*人参二醇对照（mg/L）1062.496±0.228105.9±9.69 2562.582±0.065108.5±2.76 5062.604±0.111110.5±4.70 7562.559±0.408108.6±17.3 10062.654±0.12496.28±1.29人参二醇（mg/L）加MPP+（100μmol/L）1061.710±0.079*75.54±3.37*2561.735±0.093*73.65±4.05*5061.599±0.142*67.84±6.01*7561.682±0.133*71.34±5.63*10061.798±0.121*76.26±5.14*

3 讨论

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，它可以穿越血脑屏障，在单胺氧化酶B作用下转变为有毒性的1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）后，进入多巴胺能神经末梢和胞体，选择性破坏黑质多巴胺能神经元，致多巴胺能神经元变性死亡。这种细胞死亡的主要方式是细胞凋亡［5］。用其制备的小鼠模型是目前最好的PD动物模型之一。已被广泛用于PD发病机制和治疗方法的研究［6］。本课题前期研究也发现PD模型组黑质致密带存活神经元数目和多巴胺能神经元减少。给予一定剂量的人参二醇预处理后，存活神经元数目增多，多巴胺能神经元脱失现象减少，研究结果提示：各浓度人参二醇对BV2细胞的活性无明显影响。MPP+处理后可诱导BV2细胞活性下降。且细胞活性随MPP+浓度升高而下降。本研究结果提示，人参二醇对MPP+诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。

鱼藤酮是鱼藤属植物的提取物，是农业生产中广泛使用的杀虫剂，可杀灭多种植物害虫。Betarbet R等［7］在2000年中首次使用鱼藤酮成功地诱导PD大鼠模型，其制作的模型受到了国内外学者的广泛关注。作为一种细胞毒性化合物，鱼藤酮主要生化效应是抑制细胞呼吸链对氧的利用，造成内呼吸抑制。鱼藤酮对线粒体复合物1有较强的亲和力，可选择性阻断铁-硫簇与泛醌Q的作用，终止线粒体呼吸链的正常运转。造成氧化应激及ATP生成障碍，线粒体膜通透性增加，大量释放凋亡刺激因子和凋亡诱导因子，激活Caspases酶系，引起细胞凋亡［8］。由于鱼藤酮能产生与PD流行病学和病理特征更为相似的表现，因而可能在机制上更接近与人类PD的自然病程［9］。本研究发现，鱼藤酮处理后可诱导BV2细胞活性下降且活性随鱼藤酮浓度的升高而下降。而人参二醇不能促进细胞增殖，不能逆转鱼藤酮诱导的细胞活性。

综上所述，人参二醇对MPP+或鱼藤酮诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。

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ObjectiveTo evaluate the effects of panoxadiol on the decreased cytoactive in BV2cells（a cell line derived from microglia of the mice） induced by Rotenone or MPP+.MethodsTreated with Rotenone（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）or MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）for 24h to induce the decreased cytoactive in BV2 cells..They were divided into a negative control group，panoxadiol（100 mg/L）control group，Rotenone（0.1μmol/L）or MPP+（100μmol/L） injury group，and panoxadiol（10、25、50、75、100mg/L treatment group respectively. Cytoactive was detected by MTT method.ResultsPanoxadiol（10、25、50、75、100mg/L）per se had no affects on the cytoactive of BV2 cells. Treatment of Rotenone or MPP+ for 24h may result in the decreased cytoactive in BV2cells，panoxadiol（10、25、50、75、100 mg/L）failed to improve the decreased cytoactive in BV2cells induced by Rotenone or MPP+.ConclusionsPanoxadiol had no protection effects on the decreased cytoactive in BV2cells induced by Rotenone or MPP+.

Panoxadiol Rotenone or MPP+ Mice BV2cell

浙江省卫生厅中医药科技研究项目基金（2008CA115）

322000 浙江省义乌市中心医院内科（金晓蓉 方桂伦）310006 浙江省中医院血液病研究所（孙馨 林筱洁 苗青 高瑞兰）