致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展

陆盼盼 郭松林 关瑞章 冯建军

（集美大学水产学院，厦门 361021）

致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展

陆盼盼 郭松林 关瑞章 冯建军

（集美大学水产学院，厦门 361021）

弧菌为水产养殖环境中常见的条件致病菌，其暴发可导致养殖鱼虾贝类大量死亡。由于常用的化学药物防治方法存在耐药性、药物残留等问题使得弧菌病的防治面临新的挑战，因而如何获得安全有效的防治方法成为弧菌所致疾病研究的重点和难点。弧菌为革兰氏阴性菌，外膜是该类型菌细胞壁特有的结构，由蛋白、糖和脂质构成。其中外膜蛋白易为宿主免疫系统识别为异物，可以激发机体的体液免疫和细胞免疫，有可能作为弧菌疫苗的有效成分。对弧菌外膜蛋白免疫原性的研究进展作一综述，以期为弧菌病的防治在外膜蛋白水平上提供一种有效的解决途径。

弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保护作用 交叉免疫保护作用

1 致病性弧菌及其所致疾病

近年来，随着鱼类养殖规模的不断扩大，鱼类病害频繁发生，对鱼类规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，海水养殖鱼类尤以弧菌病较为严重，已成为人们研究关注的焦点。弧菌为一类革兰氏阴性、兼性需氧的杆菌和弯曲杆菌，是水产养殖环境中常见的条件致病菌，弧菌病的暴发可导致养殖鱼虾贝类大量死亡［1］。弧菌属共包括46个种类，其中12种与人类感染相关，超过27种与鱼类和贝类感染有关［2］。国内外学者调查发现弧菌病的发生既没有宿主种属选择性和地理差异性，亦无季节性和时间的区分，夏秋两季较多发，流行适宜温度为25-32℃。引发弧菌病的病原性弧菌最早从欧洲鳗鲡中分离获得，迄今为止报道的水产养殖动物致病性弧菌有数十种之多（表1）。感染弧菌病的水产动物主要有皮肤溃疡、烂尾、烂鳍及出血等症状，从而引发动物对外界反应迟钝以及摄食率下降等。国内外已经报道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、鳗弧菌（V. anguillarum）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、哈维氏弧菌（V. harveyi）、

创伤弧菌（V. vulnificus）、拟态弧菌（V. mimi cus）、产气弧菌（V. gazogenes）和河弧菌（V. f luvialis）等［3］。弧菌病常采用化学药物消毒预防和抗生素治疗，但近年来长期滥用抗菌素不仅造成严重的环境污染和药物残留问题，而且使得致病性弧菌对药物的耐药性不断增强，产生了许多新的耐药菌株，传统药物的治疗效果越来越差，使得弧菌病的防治面临着新的挑战［1］。因此，如何获得安全有效的防治方法成为该研究领域的重点和难点。

表 1 水产动物主要致病性弧菌及其宿主

2 外膜蛋白的基本特征和弧菌主要外膜蛋白

革兰氏阴性细菌的外膜是细胞壁的主要结构，在细菌与宿主的相互关系中发挥着重要作用，外膜具有典型的非对称性磷脂双层结构，位于菌体胞浆膜和肽聚糖的外侧，将整个细菌包围，膜厚度约8-10 nm，由蛋白、糖和脂质构成［4］。外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）位于细胞壁表层，是革兰氏阴性菌特有的外膜主要结构成分，在维持细菌细胞结构稳定、细胞的物质交换及细菌的致病过程中起着十分重要的作用，并且易为宿主免疫系统识别为异物，不仅可以激发机体的体液免疫应答，而且还可引起细胞免疫且副作用较小，有可能作为疫苗的有效成分［5-8］。Chart等［9］从鳗弧菌中分离出的2个小分子量的外膜蛋白，能够有效地刺激机体的免疫反应。

OMPs是重要的黏附因子，宿主的免疫防御系统能很容易识别这些外来物质［10］。OMPs具有高度疏水结构可维持结合反应，在宿主感染和致病性中起重要作用，同时OMPs可粘附于黏膜上，与肝脏相关的淋巴组织抗原递呈细胞可很容易地将其作为抗原递呈给免疫细胞［11］。通过NCBI对弧菌外膜蛋白基因搜索可发现弧菌的外膜蛋白主要有OmpK、 OmpU、OmpW及TolC，比对分析表明这些外膜蛋白在不同弧菌间的保守性均较高。

氨基酸序列比对结果表明，外膜蛋白OmpU、OmpW和OmpK在副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌及创伤弧菌中有高度相似性，表明这些蛋白有相似的生物功能［12］。OmpU是重要的膜孔蛋白之一，也是疫苗开发的重要保护性抗原，由OmpU基因编码，分子量为38 kD，是一种孔通道蛋白，可作为亲水性和低分子量物质输入输出的通道；OmpU占外膜蛋白总量的30%左右，研究证明，外膜蛋白OmpU 是霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的重要保护性抗原之一［13-16］。富含β-转角结构的外膜蛋白W（OmpW），成熟蛋白分子量为21 kD，该蛋白的表达依赖体外环境，可能与压力条件下的适应机制有关［17，18］。外膜蛋白K（OmpK）为弧菌属的广泛受体，属于TSX孔蛋白家族，富含β折叠结构，形成狭长的疏水离子通道，该蛋白与调节细胞渗透压功能有关［2］。

3 弧菌外膜蛋白免疫原性研究

外膜蛋白位于病原菌表面，多数外膜蛋白具有良好的免疫原性，容易被宿主免疫防御系统识别为异物，从而通过一系列连锁反应引发机体的体液免疫与细胞免疫。目前已有大量关于弧菌外膜蛋白免疫原性研究的报道，获得外膜蛋白主要有分离纯化和重组表达两种方法。

3.1 弧菌外膜蛋白的分离纯化及其免疫原性

目前用于分离获得外膜蛋白的方法主要有十二烷基磺酸钠SDS、SarkosyⅠ和苯甲基磺酰氟PMSF法。其中PMSF分离获得的蛋白条带多且密集，难以区分主要外膜蛋白；SarkosyⅠ操作方法简便且能达到与SDS法相似的效果［19］。研究表明，无论是粗提的外膜蛋白混合物OMPs还是进一步分离获得的单一外膜蛋白成分均具有良好的免疫原性［20］，并且某些弧菌外膜蛋白能对相应弧菌病原菌的感染提供65%-100%的免疫保护率（表2）。这些研究为开发以弧菌外膜蛋白作为主要抗原的弧菌疫苗奠定了良好的基础，但分离纯化法一次获得的外膜蛋白量少并且操作过程复杂，因而广泛应用于生产实践还有一定的困难。

表2 分离纯化的弧菌OMPs免疫原性分析

3.2 弧菌外膜蛋白的重组表达及其免疫原性

随着基因组学、蛋白质组学以及生物信息学等学科的迅速发展，越来越多的弧菌OMPs基因序列测序工作得以完成。根据NCBI数据库获得所需外膜蛋白基因序列设计特异性引物扩增出目标基因，构建合适的载体进行重组表达，从而在一定程度上提高了外膜蛋白疫苗抗原筛选的进度。这类基因工程疫苗生产成本低，易于规模化生产。目前，已有来源于副溶血弧菌［26，27］、哈维氏弧菌［28，29］、溶藻弧菌［30］等弧菌的OMPs得以成功重组表达与纯化，并且分别在鱼体中进行了免疫接种试验。结果显示，这些重组OMPs保持了天然OMPs的免疫原性和免疫保护作用，能有效刺激鱼体产生特异性抗体，并且能对相应病原菌的感染提供67.6%-90%不等的免疫保护率（表3）。

3.3 弧菌OMPs多联疫苗的免疫原性

细菌脂多糖、外膜蛋白偶联疫苗是20世纪80年代发展起来的新型疫苗。李华等［22］制备了哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗，结果表明免疫卵形鲳（Trachinotus ovatus）后，脂多糖偶联外膜蛋白免疫原性显著增强，对哈氏弧菌的免疫保护率为95%，高于单独0MPC免疫组的75%保护率。基因工程技术的迅速发展使得渔用疫苗的开发周期和成本大幅度缩短和降低，并且利用生物技术构建的重组OMP疫苗也颇具应用前景。值得一提的是，郑磊等［31］利用副溶血弧菌外膜蛋白K（OmpK）和鞭毛蛋白A基因（flaA）构建融合表达载体，重组表达的融合蛋白（r-FlaA-OmpK）免疫美洲黑石斑鱼，与单一的重组蛋白（r-OmpK）相比，能够刺激机体产生更高水平的抗体效价和免疫保护作用。副溶血弧菌tdh2基因和鳗弧菌OmpU基因二联疫苗免疫大菱鲆可对副溶血弧菌和鳗弧菌感染分别提供100%和35%的免疫保护率［32］。

3.4 弧菌外膜蛋白共同抗原的免疫原性

弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种（血清型或亚种）弧菌的混合感染，因此筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原，作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯选成分具有重要意义。研究发现，革兰氏阴性菌的外膜蛋白中存在保守成分，同种细菌不同菌株的外膜蛋白图谱很相似，仅有很小的差异，这些差异与菌株的血清型、致病性及生长条件有关［33］。张崇文等［34］利用双向电泳和免疫印迹相结合的方法，借助于质谱分析技术发现，溶藻弧菌的 一种功能未知的孔蛋白（Porin，GenBank Accession No. ZP_01260407）和副溶血弧菌的一种麦芽糖孔蛋白的前体蛋白（Maltoporin precursor，GenBank Accession No. NP_801154）能够和哈维氏弧菌全菌多抗产生免疫反应，表明这两种蛋白可以作为此3种弧菌的交叉保护性抗原。根据SDS-PAGE图谱及免疫印迹发现，来源于8株弧菌的36 kD外膜蛋白均能与兔抗SR1菌株的血清发生免疫反应，证明36 kD 的外膜

蛋白可能是弧菌共有的特异性抗原［4］。田丁等［35］研究发现38 kD为溶藻弧菌与创伤弧菌共有的外膜蛋白，为探讨研制两者的外膜蛋白亚单位联合疫苗、达到一种疫苗有效防治2种疾病的目的提供了可能性［35］。另外，研究发现28 kD的OMP是鳗弧菌（V.anguillarum）和副溶血弧菌的共同抗原［36］，但该外膜蛋白对这两种弧菌的免疫防治效果尚未见研究报道。

表 3 弧菌重组OMPs免疫原性分析

3.5 弧菌OMPs口服疫苗的尝试

相比于注射免疫及浸泡免疫，口服免疫具有高效性，操作方便，避免对鱼体造成损伤，并能同时引起黏膜免疫应答及系统免疫应答等诸多优点［37］。自1942年Duff［38］首次将杀鲑气单胞菌灭活口服疫苗应用于硬头鳟获得成功后，国内外不少学者对鱼类肠道黏膜免疫机制的研究不断深入，鱼类口服疫苗的研究取得了一定的进展。

任燕等［39］采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-co-polyethylene glycol，PELA），包裹哈维氏弧菌重组外膜蛋白OmpK后，制备成PELA-OmpK微球口服免疫鲫鱼（Carassius auratus gibelio）。结果表明，加强免疫4周和8周后微球疫苗免疫组可对活菌攻击提供70%的免疫保护率，显著高于口服OmpK蛋白组和空白对照组。

4 展望

分离纯化和重组表达获得的弧菌外膜蛋白均具有良好的免疫原性，相对于分离纯化法，重组表达操作过程简单，单次获得量多。不同种弧菌间的共同外膜蛋白的筛选可有望解决针对单一致病性弧菌研制疫苗时存在的周期长、免疫次数多的弊端，因而极有可能成为有效的弧菌亚单位疫苗抗原成分。随着生物技术在鱼用疫苗开发中的应用，弧菌OMPs多联疫苗的构建使得外膜蛋白的免疫保护性显著增强并可实现单次免疫同时抵抗多种弧菌感染的效果。然而，国内外将不同属病原菌外膜蛋白构建融合表达载体制备二联疫苗的研究十分少见。本实验室课题组成员已成功制备迟缓爱德华氏菌OmpS2与嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白二联疫苗，免疫美洲鳗鲡后可提供较高的免疫保护性［40］。在此基础上进行弧菌属与其他种属细菌二联外膜蛋白的研究，以期能达到单次免疫防治多种细菌感染的目标。另外值得一提的是，以弧菌OMPs进行免疫保护研究时，常用的注射方法虽然用量小、效果好但易造成伤口感染且工作量大，免疫途径有待优化，可尝试口服免疫。

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（责任编辑 狄艳红）

Review on the Immunogenicity of Pathogenic Vibrio Outer Membrane Proteins

Lu Panpan Guo Songlin Guan Ruizhang Feng Jianjun
（Fishery College，Jimei University，Xiamen 361021）

Vibrio is a common opportunistic pathogen in aquaculture environment, which can lead to an outbreak of mass mortality of fish and shellfish farming. Traditional chemical control methods because of drug resistance, drug residues and other issues make Vibriosis prevention face new challenges, and thus how to get safe and effective prevention and treatment of diseases caused by Vibrio becomes important and difficult. Vibrio is Gram-negative bacteria, the outer membrane is unique to the cell wall of this type of bacteria, which consist of protein, sugar and lipid. The outer membrane protein is easy to be recongnized as foreign by the host immune system then stimulate the humoral and cellular immunity, which may be used as an active ingredient of Vibrio vaccines. A review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein is to provide a new solution for the prevention and treatment of Vibriosis.

Vibrio Outer membrane proteins Immunogenicity Immuno-protection Cross immuno-protection

2013-08-16

国家自然科学基金项目（31001136）

陆盼盼，女，硕士研究生，研究方向：水产动植物病害防治；E-mail：993814556@qq.com

郭松林，男，副教授，硕士生导师，研究方向：水产病原微生物学与免疫学；E-mail：gsl@jmu.edu.cn