海绵共附生真菌多样性及其次级代谢产物的研究进展

宋恺胡洁林文翰季宇彬

（1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076；3. 北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191）

海绵共附生真菌多样性及其次级代谢产物的研究进展

宋恺1，2，3胡洁3林文翰3季宇彬1，2，3

（1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076；3. 北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191）

海绵由于其独特的生理结构、进食方式使其体内部聚集了大量的微生物，这些微生物产生了多种结构新颖的生物活性物质，因此海绵及其共附生微生物的研究成为了海洋药物研发的热点。就海绵中共附生真菌的分布情况，新技术的应用及其生物次级代谢产物的生物活性展开综述。

海绵 共附生真菌 次级代谢产物 化学防御 生物活性

1 海绵与其共附生微生物关系

海绵（Sponge）是地球上最原始的无脊椎生物，属于多孔动物门（Porifera），共有1 000多种，占所有海洋动物总数的1/15。作为底栖生物，海绵附着于海洋底层，通过不断振动体壁的鞭毛，使含有食饵的海水不断从这些小孔渗入瓶腔，进入体内。当海水从瓶壁渗入时，水中的营养物质，如动植物碎屑、藻类、微生物等，便被领鞭毛细胞捕捉后吞噬。营养物质被消化吸收，废物随海水从出水口流出体外。在这个过程中，可以过滤70%以上的微生物。所以一株海绵中常常存有上百种微生物［1，2］。

这些共附生的微生物涵盖了放线菌、细菌、真菌等。按分布位置可分成3类：（1）海绵体表附生的微生物，种类与外界微生物种类相似，随着海洋环境的变化而变动；（2）没有被海绵吞噬的微生物，会驻留在海绵中质层内，是海绵共附生微生物中数量最多的一类；（3）长期寄居在海绵细胞细胞核内的微生物，其具有宿主特异性［2］。

在长期共同进化的过程中，海绵与其共附生微生物之间形成了奇妙的关系。产生了许多具有特殊结构和生理学功能的活性物质、构建了强大的化学防御武器。早前的研究，一直将研究的重点集中在海绵个体上，没有考虑到海绵与其共附生微生物的关系，忽略了微生物对于海绵的特殊意义。最近的

研究显示，从海绵来源微生物发酵液中分离到的化合物结构与之前从其宿主中获得的化合物结构十分相似，因此有人推测，在海绵中分离到的很多化合物可能都由附生在其中的微生物产生［3］。2004年，科学家们从Theonella swinhoei海绵中发现了两种物质［4］，它们的结构中都包含了聚酮骨架结构。而编码这一类结构的基因经测序、比对，发现是来源于一种原核生物，就此推测该化合物可能是由附着在海绵上的细菌产生的［4］。

虽然目前还不能明确海绵共附生微生物在海绵生活过程中所承担的具体作用，但是有越来越多的证据显示，它们是一个和谐的有机体。2004年Perovic-Ottstadt等［5］首次报道了Suberites domuncula海绵的细胞表面存在一种可以识别1，3-β-葡萄糖的受体，人们就此推测海绵就是依靠这种分子机制来辨别其周围环境中的真菌。此外，2006年，Rot等［6］在海绵体内发现了具有内含子的线粒体，而海绵的线粒体基因组中不含有内含子。这说明海绵与其他物种之间出现了水平基因的转移，此线粒体后被证实来源于一种真菌。这一发现提示，在微生物与其寄主之间可能存在某些特殊的交流方式。

2 新技术的应用

由于近些年来分子生物学技术的快速发展，许多新技术应用到了海洋微生物的研究领域。例如，PCR扩增技术、16S DNA文库、限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和荧光原位杂交技术（Fluorescentin situhybridization，FISH）等的应用，使得许多不可培养的海绵共附生微生物的相关研究取得了进展，更多的菌种被发现，丰富了海洋微生物的多样性［7］。

2.1 PCR聚合酶链反应

PCR是一种常用的分子生物学技术，是通过模拟生物体内的遗传物质的复制过程，实现在体外对DNA或RNA片段进行扩增。PCR技术的特点在于可快速从微量样品中得到我们所需要的基因信息，无需大规模的发酵培养，非常适合复杂微生物体系的研究，可以在分子水平对于共生微生物进行菌种鉴定，功能基因的筛选等。除此之外，PCR扩增也是克隆文库建立、酶切试验中的一个组成部分。

2.2 16S rDNA/18S rDNA

由于16S rDNA、18S rDNA的高度保守性，一直被广泛地应用于菌种的鉴定分析及微生物遗传性研究。科研人员可通过设计特定引物，应用PCR扩增得到目的片段，经测序后比对，得到未知菌种的生物学信息，这是目前公认的比较快速、有效的鉴定分类方法。关于海绵中共附生细菌16S rDNA的研究较多，相关真菌的信息报道较少。上海交通大学科研人员完成了我国永兴岛海域海绵共附生真菌的相关研究［8］，通过对保守区18S rDNA的研究建立了进化树，分析了种属间的亲缘关系丰富了菌种的多样性，确立了微生物的进化和分类关系。

2.3 DGGE

DGGE即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。近些年来，海绵共附生微生物的研究中也应用了这一技术。

DGGE对微生物的分析通常包括：DNA提取，16S rRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。也可通过基因克隆、建立16S rDNA文库，通过系统发育树的建立，分析微生物多样性信息。 这项技术的优势在于，可以避免对与同一个生物体中存在的多个相似度高的菌株进行重复研究，最大程度上的降低试验量。

2.4 RFLP

RFLP是一种利用限制性核酸酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。Lee等［9］为了研究济州岛海域海绵中微生物的种群信息，利用RFLP技术对分离自海绵的微生物进行酶切，将170株微生物分成了19个代表型。中科院大连化学物理所的研究人员利用巢式PCR和RFLP的方法对两株海绵中的非培养的微生物进行研究，结果196株微生物被分成了46个代表型，证实了海绵中微生物的多样性。这次试验的成功也为日后设计分离不可培养微生物作出了尝试［10］。

3 海绵共附生真菌多样性及其分布情况

2008年，Li等［11］从海绵Gelliodesfibrosa、Haliclona caerulea和Mycalearmata中分离到可培养真菌235株，通过形态学分类并用分子生物学的方法对其保守区域进行扩增，将其归为26个属；同年，Gao等［12］对另外两种海绵Suberiteszeteki和Mycalearmata展开共附生真菌种群多样性的研究，略有不同的是，此次研究并没有通过分离培养后抽取DNA的方法进行PCR扩增，而是将海绵及其共生微生物的基因组同时提取出来，建立基因文库、利用 DGGE 的方法阐述共生微生物的多样性，此方法将分离到的共生真菌归为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）下11个目下的44种。2011年，Zhou等［8］分离并鉴定了来源于我国南海的海绵共附生真菌177株并进行了RFLP酶切多态性分析，通过18S rRNA 的扩增、测序、BLAST比对发现，这些分别属于子囊菌门（Ascomycota）下4个目的10个属。其中青霉属（Penicillium）和曲霉（Aspergillus）是优势种群。并利用分子探针对其PKS、NRPS基因簇进行筛选和测序比对。

2013年，巴西科学家从海绵等海洋生物中分离了得到了256株真菌，181株细菌［13］。利用PCR扩增真菌28S rDNA、细菌16S rDNA序列。并利用先进的扩增核糖体DNA限制性分析（Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）技术选取不同的内切酶，对扩增得得到的保守序列进行酶切，最后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。揭示了海绵中丰富的微生物资源，而ARDRA技术的应用也帮助人们更好地了解微生物种群多样性。

4 共附生真菌相关代谢产物及其活性的研究

早在1950年就有报道说从海绵中分离到活性物质，此后陆续从海绵中发现许多结构新颖，活性特异的化合物。海绵及其共附生真菌中的活性物质具有易成环、不饱和程度高等特点。主要的生物学活性包括细胞毒、抗菌、抗病毒、生物毒素和酶抑制剂等［14］。

4.1 抗肿瘤、细胞毒活性

自从1997年，日本科学家第一次报道了海绵共生真菌产生的3种活性物质对于P388淋巴癌细胞具有显著的细胞毒活性［15］以来，越来越多的海绵真菌来源的活性物质被发现具有抗肿瘤活性。

2011年，Cohen等［16］在地中海海绵Psammociniasp.的共生真菌Aspergillus insuetus的发酵液中提取到了7个化合物，其中4个化合物（1-4）属首次发现（图1）。

图1 化合物1-7结构图［16］

对这7种化合物进行抗真菌Neurospora crassa及对于MOLT-4人急性淋巴母细胞白血病细胞的药理学试验，结果显示，化合物1、6、7的最低抑菌浓度分别为140、242和162 μmol/L。化合物3、4、7对于MOLT-4细胞的抑制率分别为51%、55%、72%。

2012年，Sun等［17］从Xestospongia testudinaria海绵中的Aspergillussp.的发酵液中分离到3个新化合物disydonols A-C（8-10），和一个已知化合物（S）-

（+）-sydonol（11）（图2）。

图2 化合物8-11结构图［17］

通过MTT法对于HepG-2和人宫颈癌细胞进行测试，发现化合物1和3显示出细胞毒活性，IC50值分别为9.31、2.40 μg/mL，2.91和10.20 μg/mL。而化合物2则没有细胞毒活性IC50＞100 μg/mL）。

2013年，Amagata等［18］从海绵来源的真菌Gymnascella dankaliensis分离到了一种聚酮酪氨酸类的衍生物dankastatin C（12）和一种已知的类固醇化合物demethylincisterol A3（13），（结构见图3），这种化合物第一次被发现是在Homaxinella 海绵中。Dankastatin C（12）显示出对于淋巴细胞白血病P388有很强的抑制作用。阳性药物五氟尿嘧啶作为阳性药物，ED50值为78 ng/mL。

图3 化合物12-13结构图

4.2 抗菌

据统计，有微生物生物膜参与的感染占到人类感染性疾病的总数的80%，这已严重威胁到了人类的健康。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一种寄居在人皮肤的正常菌群，一般情况下不会引发疾病，是一种机会致病菌，由于近年来临床治疗中越来越多的医疗设备器材的使用，有关表皮葡萄球菌致病的消息屡见不鲜，其引发的感染日益严重，目前已经成为临床中最常见的病原体。加之近些年抗生素的过度使用，导致临床上耐药菌株大量产生，新型抗生素的研究成为药物研究的热点。2013年，Scopel等［19］从海绵来源的一株真菌Penicilliumsp. F37中分离到一种环二肽类化合物，药理学试验发现这种化合物可以通过抑制微生物生物膜的形成来影响致病菌的生长，对临床常见致病菌表皮葡萄球菌的抑制率达到了85%，是一种很有潜力的抗菌先导化合物。

Kong等［20］在海绵的真菌Metarhizium anisopliae mxh-99发酵液中分离到的两种化合物对于枯草分支杆菌的抑制作用，isochaetochromin B2（6）和ustilaginoidin D（7）的MICs值为50.0 μg/mL。对于肺结核致病菌有较强的抑制作用。

Subramani等［21］从Melophlussp.海绵中分离得到的Penicilliumsp.中分离到了桔霉素，此前的研究结果显示，桔霉素对于多种多药耐药菌株具有很强的抑制作用。对鳃足虫幼虫也有细胞毒活性。

2010年，Meenupriya等［22］在科瓦蓝海岸采集

到Callyspongiaspp.海绵样品分离了海绵中可培养的共附生真菌，并对其进行ITS和5.8S区的分子水平鉴定。而后将待测的6株真菌与致病菌（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）共培养，通过测量抑菌环大小的方法来判断抑菌活性强弱，结果显示真菌Aspergillus flavus显示出潜在的抗菌活性。对这金葡菌和大肠杆菌的抑菌圈分别为18和31 mm。而两种真菌滤液的抑菌效果更强，对以上两种的抑菌圈分别为27和42 mm，显示出很强的抑菌活性。

4.3 抗病毒

海水中存在大量的致病菌群，而海绵为了免遭感染，在长期进化的过程中，与其共附生微生物形成很好的默契，产生了一系列具有抗微生物的活性物质。Peng等［23］在海绵来源的Epicoccumsp.JJY40中分离到一个新化合物（14）以及一个已知结构化合物（15）发现这类含有长链的结构，在天然产物中是很少见的。并对这两种化合物进行抗H1N1病毒的活性试验，结果显示两者的IC50值分别为91.5和 101.3 μmol/L。而传统抗病毒药利巴韦林作为阳性参考的IC50值为114.8 μmol/L。这两种化合物下显示出很强的抗病毒活性。化合物1还对NF-κB有抑制作用，是一种极具开发价值的先导化合物，结构见图4。

图4 化合物14-15结构图［23］

4.4 抗疟原虫

Almeda等［24］在海绵Callyspongiasp. cf.C. flammea中分离到一种真菌Stachylidiumsp.分离得到4种化合物marilones A-C，silvaticol。其中marilones A B的骨架结构很少见。它们的生物学活性也特殊，其中marilones A可以抑制疟原虫肝期感染。其IC50值为 12.1 μmol/L，Marilone B（2）表现出对于5-HT的拮抗作用。

4.5 降解污染物

海绵生活在海洋中，而每天有大量的污染物被排放入海，这势必会给海绵带来伤害。不过我们采集到的海绵，体表都很光滑、洁净。推测海绵中可能附生着可以降解油污的微生物。

Kirana等［25］在印度半岛海域采集到的海绵Fasciospongia cavernosa中分离到了一种共附生真菌Aspergillus ustus MSF3，并在其中发现了一种生物表面活性剂20℃时，pH7.0时使用葡萄糖肉汤为培养基时，这种活性产物的产量最高。此课题组也报道了筛选具有表面活性剂潜力生产菌的方法。

4.6 其他

海绵生活在复杂的海洋中，经常要面对来自各方面的威胁，许多水生生物如壶藻，藻类等喜欢附着在其他生物体表面，掠夺其他生物的生存空间和食物。海绵共附生的微生物就会产生一些具有化学防御作用的活性物质来保护自己和宿主。赵琨等［26］在中国南海海绵中分离获得一株真菌Pleosporaceaesp.［27］，发现，其发酵液的乙酸乙酯提取物对丰年虫具有较强的杀伤性，同时表现出对藤壶幼虫的抑制作用。

5 小结

我国海域辽阔，海绵及其他底栖生物资源极为丰富。其中所富含的微生物资源更是天然宝藏。且微生物具有繁殖快，培养成本低廉等特点、可综合利用发酵等现代技术进行大规模的工业化生产，因此海绵共附生微生物来源药物具有极大的开发潜力。

本实验室开展了海绵来源微生物多样性及天然代谢产物性的研究工作，从海绵及珊瑚中分离可培养真菌400余株，在海绵来源真菌的发酵液分离到天然产物。运用现代分子生物学手段，通过PCR的方法扩增真菌ITS rDNA 进行分子水平的鉴定，已完成的工作发现这些可培养真菌分属于30余属，其中优势菌种为曲霉（Aspergillus）和枝孢菌（Cladosporium）。这与之前李志勇等的研究报道中有关海绵共附生微生物的种群分布情况有所不同，分

析原因可能是由于海绵所在海域及其种类不同造成的，而另一个主要的原因经推测可能是在研究中使用了不同的微生物筛选条件及鉴定方法产生了不同的结果。我们还对真菌18S rDNA进行RFLP酶切试验及药理活性筛选，研究其生物多样性及活性。与此同时，根据分离得到的化合物结构进行了生物合成途径的推测，利用功能酶基因作为探针在建立的Fosmid文库中对合成相关基因簇进行筛选。其他相关工作也在同步进行中。

目前这一领域存在很多亟待解决的问题。首先，能够进行实验室人工分离到并可培养的共附生微生物仅占全部微生物的很小一部分，绝大多数微生物类群仍然未被分离和认识。其次，在千百年的进化过程中海绵与其共附生微生物构成了和谐的整体，为了应对海洋中捕食者的猎杀、竞争者的侵略、病原菌的侵害及环境胁迫等情况，产生了一系列独特的化学防御物质，这些活性物质在抗炎、抗病毒、抗氧化发挥着特殊的作用。但是，很多特殊结构功能的次级代谢产物是在特殊环境中应激所产生的，而在实验室培养的条件下，这些代谢通路可能关闭，如何使这些沉默基因表达值得人们思考。例如，进行菌种间的共培养、模拟生物体原本的生活环境等。再者，科学家们已经进行了大量微生物代谢产物的化学分离工作，新结构的化合物层出不穷，但相关药理学筛选模型还比较单一，针对性不强。如果从化学生态学的角度分析这些活性物质的产生原因，或许可以认识这些结构各异的化学物质的独特活性。除此之外，近年来基于分子生物学技术在海洋微生物代谢产物研究中的应用，一系列生物合成基因簇被发现，相关化合物的生源途径的研究也有报道。不过相较于陆生微生物，人类对于海洋微生物的了解还知之甚少。如何优化使用这些现代分子生物学技术，对于人们进一步认识、利用海洋微生物资源，开发海洋药物有着极其重要的意义。

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（责任编辑 狄艳红）

Studies on Diversity of Sponges-associated Fungi and Their Secondary Metabolites

Song Kai1，2，3Hu Jie3Lin Wenhan3Ji Yubin1，2，3
（1. Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University o f Commerce，Harbin 150076；2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs，Ministry of Education，Harbin 150076；3. State Key Laboratory of Natural and Biommietic Drugs，Peking University，Beijing 100191）

Because of the unique physiological structure and digest system, marine sponges enrich large numbers of microorganisms. Lots of novel bioactive compounds were isolated and identified from sponges-associated fungi, which is highlight in marine drug discovery. The development on the distribution of fungi, the application of new technique, novel bioactive secondary metabolites and biological activities were reviewed.

Sponge Symbiotic-fungi Secondary metabolites Chemical defense Bioactivity

2013-09-29

国家“863”计划项目（2011AA090701）

宋恺，男，硕士研究生，研究方向：海洋天然产物生物合成；E-mail：unochris1314@163.com

季宇彬，男，博士生导师，研究方向：抗肿瘤药物；E-mail：jyb@hrbcu.edu.cn