转AtNDPK2基因甘薯的耐盐性鉴定

王庆美等

摘要：以转AtNDPK2基因甘薯植株为试材，根据其生理指标及表型变化来鉴定转基因甘薯的耐盐性。室内鉴定结果表明：在100、150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6的根长显著高于对照。田间鉴定结果表明：在50 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6生长正常，而对照10 d后出现黄叶及枯萎等症状；在100 mmol/L NaCl胁迫下，对照植株和JN2～JN6在处理4 d后出现枯萎，而JN1生长正常。

关键词：甘薯；转基因；AtNDPK2；根长；耐盐性

中图分类号：S531.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的粮食作物及新型能源作物，我国甘薯种植面积占世界甘薯种植总面积的69%，产量占世界总产量的85%。在甘薯生产中，各种环境胁迫和病虫害对其产量和品质危害很大。世界范围内，适宜耕作的土地已经不足10%，很多作物包括甘薯都种植在干旱、盐渍、低温等逆境环境中，随着耕地的不断减少和能源压力的不断增大，培育出能够在逆境生长且品质优良的甘薯品种成为甘薯育种工作者的重要任务。

虽然常规甘薯育种技术在品种改良中发挥了重要作用，但由于种质基础日益狭窄，甘薯种内、种间杂交不亲和性等因素[1]，使常规育种受到限制。利用植物基因工程技术能够克服常规育种中存在的物种隔离和基因连锁等妨碍，对甘薯品种选育和生产具有潜在的推动意义。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为济薯21试管苗，由山东省农业科学院作物研究所提供。转基因植株为转AtNDPK2基因的济薯21再生苗。将再生的转基因小植株切下，MS固体培养基上培养，培养条件为（27±1）℃、光照13 h/d。每2个月继代1次。

1.2再生苗的分子鉴定

甘薯总 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 为被检测拟转基因植株总DNA、非转基因植株总 DNA（阴性对照）和pCAMB2300-AtNDPK2质粒（阳性对照）。AtNDPK2基因的引物序列为：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，预计扩增片段长度 1 205 bp。NPTII基因引物为5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，预计扩增片段长度 750 bp左右。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）复性1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外成像仪中观察并拍照。

1.3转基因植株的室内鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，切取茎尖顶端2～3 cm，分别转接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培养基上，28℃、16 h/d光照条件下培养20 d，测定根长。每个处理5株，重复3次。

1.4转基因植株的田间鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，转移到育苗基质中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照条件下培养6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液进行浇灌，每个处理5盆，重复3次。每隔24 h观察植株表型变化。

2结果与分析

2.1转基因植株的PCR检测

PCR检测结果（图1）表明，有11个拟转基因植株及阳性对照扩增出1 205 bp的条带，初步证明这些植株为转基因植株，阳性率达到84.6%。NPTII基因的扩增结果与AtNDPK2结果类似。

2.2转基因植株的室内鉴定

根长结果（图2）显示，正常条件下（NaCl浓度为零），转基因植株与对照的根均能够很好的生长。随着NaCl浓度的提高，根的生长受到抑制，但转基因植株的根长始终大于非转基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 胁迫下，转基因植株的根长显著高于对照。

3结论与讨论

盐胁迫条件下，植物细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生，大多数植物体内的游离脯氨酸含量都异常升高。臧宁等（2008）[3]将从拟南芥中克隆的SOS基因导入甘薯栽培品种徐薯 18和栗子香中，获得了具有一定耐盐性的转基因植株。袁莉（2009）[4]通过农杆菌介导法将LOS5基因转入甘薯品种栗子香中，提高了转基因植株对田间盐胁迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]构建了在叶绿体中特异诱导表达的包含CuZnSOD和APX 两个基因的载体，采用基因枪法将目的基因导入甘薯中，提高了甘薯对氧化和冷胁迫的抗性；在甲基紫精的氧化胁迫诱导下，转基因甘薯叶绿体中的CuZnSOD和APX表达水平均高于对照约15倍；转基因植株在冷胁迫诱导下光合活性的降低显著低于对照，并且转基因植株能在胁迫后恢复光合活性。这些结果说明表达CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]将Cu/ZnSOD和APX基因转入甘薯，通过增强NaCl胁迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐盐性。

本试验通过转AtNDPK2基因甘薯植株的耐盐性鉴定，证明AtNDPK2能提高甘薯的耐盐性，为甘薯常规耐盐型育种提供新种质，为盐碱地的利用以及生态环境的改善提供技术储备。

参考文献：

[1]陆漱韵. 甘薯育种学[M]. 北京：中国农业出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧宁， 张美彦， 翟红， 等. 根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得[J]. 农业生物技术学报， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表达LOS5基因的转基因甘薯植株的获得及耐盐性鉴定[D]. 北京：中国农业大学， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 边晓明， 李强， 等. 转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐盐性[J]. 分子植物育种， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以转AtNDPK2基因甘薯植株为试材，根据其生理指标及表型变化来鉴定转基因甘薯的耐盐性。室内鉴定结果表明：在100、150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6的根长显著高于对照。田间鉴定结果表明：在50 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6生长正常，而对照10 d后出现黄叶及枯萎等症状；在100 mmol/L NaCl胁迫下，对照植株和JN2～JN6在处理4 d后出现枯萎，而JN1生长正常。

关键词：甘薯；转基因；AtNDPK2；根长；耐盐性

中图分类号：S531.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的粮食作物及新型能源作物，我国甘薯种植面积占世界甘薯种植总面积的69%，产量占世界总产量的85%。在甘薯生产中，各种环境胁迫和病虫害对其产量和品质危害很大。世界范围内，适宜耕作的土地已经不足10%，很多作物包括甘薯都种植在干旱、盐渍、低温等逆境环境中，随着耕地的不断减少和能源压力的不断增大，培育出能够在逆境生长且品质优良的甘薯品种成为甘薯育种工作者的重要任务。

虽然常规甘薯育种技术在品种改良中发挥了重要作用，但由于种质基础日益狭窄，甘薯种内、种间杂交不亲和性等因素[1]，使常规育种受到限制。利用植物基因工程技术能够克服常规育种中存在的物种隔离和基因连锁等妨碍，对甘薯品种选育和生产具有潜在的推动意义。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为济薯21试管苗，由山东省农业科学院作物研究所提供。转基因植株为转AtNDPK2基因的济薯21再生苗。将再生的转基因小植株切下，MS固体培养基上培养，培养条件为（27±1）℃、光照13 h/d。每2个月继代1次。

1.2再生苗的分子鉴定

甘薯总 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 为被检测拟转基因植株总DNA、非转基因植株总 DNA（阴性对照）和pCAMB2300-AtNDPK2质粒（阳性对照）。AtNDPK2基因的引物序列为：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，预计扩增片段长度 1 205 bp。NPTII基因引物为5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，预计扩增片段长度 750 bp左右。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）复性1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外成像仪中观察并拍照。

1.3转基因植株的室内鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，切取茎尖顶端2～3 cm，分别转接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培养基上，28℃、16 h/d光照条件下培养20 d，测定根长。每个处理5株，重复3次。

1.4转基因植株的田间鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，转移到育苗基质中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照条件下培养6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液进行浇灌，每个处理5盆，重复3次。每隔24 h观察植株表型变化。

2结果与分析

2.1转基因植株的PCR检测

PCR检测结果（图1）表明，有11个拟转基因植株及阳性对照扩增出1 205 bp的条带，初步证明这些植株为转基因植株，阳性率达到84.6%。NPTII基因的扩增结果与AtNDPK2结果类似。

2.2转基因植株的室内鉴定

根长结果（图2）显示，正常条件下（NaCl浓度为零），转基因植株与对照的根均能够很好的生长。随着NaCl浓度的提高，根的生长受到抑制，但转基因植株的根长始终大于非转基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 胁迫下，转基因植株的根长显著高于对照。

3结论与讨论

盐胁迫条件下，植物细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生，大多数植物体内的游离脯氨酸含量都异常升高。臧宁等（2008）[3]将从拟南芥中克隆的SOS基因导入甘薯栽培品种徐薯 18和栗子香中，获得了具有一定耐盐性的转基因植株。袁莉（2009）[4]通过农杆菌介导法将LOS5基因转入甘薯品种栗子香中，提高了转基因植株对田间盐胁迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]构建了在叶绿体中特异诱导表达的包含CuZnSOD和APX 两个基因的载体，采用基因枪法将目的基因导入甘薯中，提高了甘薯对氧化和冷胁迫的抗性；在甲基紫精的氧化胁迫诱导下，转基因甘薯叶绿体中的CuZnSOD和APX表达水平均高于对照约15倍；转基因植株在冷胁迫诱导下光合活性的降低显著低于对照，并且转基因植株能在胁迫后恢复光合活性。这些结果说明表达CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]将Cu/ZnSOD和APX基因转入甘薯，通过增强NaCl胁迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐盐性。

本试验通过转AtNDPK2基因甘薯植株的耐盐性鉴定，证明AtNDPK2能提高甘薯的耐盐性，为甘薯常规耐盐型育种提供新种质，为盐碱地的利用以及生态环境的改善提供技术储备。

参考文献：

[1]陆漱韵. 甘薯育种学[M]. 北京：中国农业出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧宁， 张美彦， 翟红， 等. 根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得[J]. 农业生物技术学报， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表达LOS5基因的转基因甘薯植株的获得及耐盐性鉴定[D]. 北京：中国农业大学， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 边晓明， 李强， 等. 转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐盐性[J]. 分子植物育种， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以转AtNDPK2基因甘薯植株为试材，根据其生理指标及表型变化来鉴定转基因甘薯的耐盐性。室内鉴定结果表明：在100、150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6的根长显著高于对照。田间鉴定结果表明：在50 mmol/L NaCl胁迫下，转基因株系JN1～JN6生长正常，而对照10 d后出现黄叶及枯萎等症状；在100 mmol/L NaCl胁迫下，对照植株和JN2～JN6在处理4 d后出现枯萎，而JN1生长正常。

关键词：甘薯；转基因；AtNDPK2；根长；耐盐性

中图分类号：S531.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的粮食作物及新型能源作物，我国甘薯种植面积占世界甘薯种植总面积的69%，产量占世界总产量的85%。在甘薯生产中，各种环境胁迫和病虫害对其产量和品质危害很大。世界范围内，适宜耕作的土地已经不足10%，很多作物包括甘薯都种植在干旱、盐渍、低温等逆境环境中，随着耕地的不断减少和能源压力的不断增大，培育出能够在逆境生长且品质优良的甘薯品种成为甘薯育种工作者的重要任务。

虽然常规甘薯育种技术在品种改良中发挥了重要作用，但由于种质基础日益狭窄，甘薯种内、种间杂交不亲和性等因素[1]，使常规育种受到限制。利用植物基因工程技术能够克服常规育种中存在的物种隔离和基因连锁等妨碍，对甘薯品种选育和生产具有潜在的推动意义。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为济薯21试管苗，由山东省农业科学院作物研究所提供。转基因植株为转AtNDPK2基因的济薯21再生苗。将再生的转基因小植株切下，MS固体培养基上培养，培养条件为（27±1）℃、光照13 h/d。每2个月继代1次。

1.2再生苗的分子鉴定

甘薯总 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 为被检测拟转基因植株总DNA、非转基因植株总 DNA（阴性对照）和pCAMB2300-AtNDPK2质粒（阳性对照）。AtNDPK2基因的引物序列为：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，预计扩增片段长度 1 205 bp。NPTII基因引物为5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，预计扩增片段长度 750 bp左右。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）复性1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外成像仪中观察并拍照。

1.3转基因植株的室内鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，切取茎尖顶端2～3 cm，分别转接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培养基上，28℃、16 h/d光照条件下培养20 d，测定根长。每个处理5株，重复3次。

1.4转基因植株的田间鉴定

选取均匀一致的转基因植株JN1～JN6及对照，转移到育苗基质中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照条件下培养6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液进行浇灌，每个处理5盆，重复3次。每隔24 h观察植株表型变化。

2结果与分析

2.1转基因植株的PCR检测

PCR检测结果（图1）表明，有11个拟转基因植株及阳性对照扩增出1 205 bp的条带，初步证明这些植株为转基因植株，阳性率达到84.6%。NPTII基因的扩增结果与AtNDPK2结果类似。

2.2转基因植株的室内鉴定

根长结果（图2）显示，正常条件下（NaCl浓度为零），转基因植株与对照的根均能够很好的生长。随着NaCl浓度的提高，根的生长受到抑制，但转基因植株的根长始终大于非转基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 胁迫下，转基因植株的根长显著高于对照。

3结论与讨论

盐胁迫条件下，植物细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生，大多数植物体内的游离脯氨酸含量都异常升高。臧宁等（2008）[3]将从拟南芥中克隆的SOS基因导入甘薯栽培品种徐薯 18和栗子香中，获得了具有一定耐盐性的转基因植株。袁莉（2009）[4]通过农杆菌介导法将LOS5基因转入甘薯品种栗子香中，提高了转基因植株对田间盐胁迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]构建了在叶绿体中特异诱导表达的包含CuZnSOD和APX 两个基因的载体，采用基因枪法将目的基因导入甘薯中，提高了甘薯对氧化和冷胁迫的抗性；在甲基紫精的氧化胁迫诱导下，转基因甘薯叶绿体中的CuZnSOD和APX表达水平均高于对照约15倍；转基因植株在冷胁迫诱导下光合活性的降低显著低于对照，并且转基因植株能在胁迫后恢复光合活性。这些结果说明表达CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]将Cu/ZnSOD和APX基因转入甘薯，通过增强NaCl胁迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐盐性。

本试验通过转AtNDPK2基因甘薯植株的耐盐性鉴定，证明AtNDPK2能提高甘薯的耐盐性，为甘薯常规耐盐型育种提供新种质，为盐碱地的利用以及生态环境的改善提供技术储备。

参考文献：

[1]陆漱韵. 甘薯育种学[M]. 北京：中国农业出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧宁， 张美彦， 翟红， 等. 根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得[J]. 农业生物技术学报， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表达LOS5基因的转基因甘薯植株的获得及耐盐性鉴定[D]. 北京：中国农业大学， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 边晓明， 李强， 等. 转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐盐性[J]. 分子植物育种， 2011， 9（6）：754-759.