川滇高山栎体胚诱导关键影响因素研究

张翠叶，辛福梅，杨小林，洛桑曲杰

(1 西藏自治区林业调查规划研究院，西藏 拉萨 850000；2 西藏大学 农牧学院，西藏 林芝 860000)

体细胞胚胎发生是指在离体条件下使植物体细胞通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的过程。相对于器官发生而言，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。体细胞胚胎发生为植物细胞分化、全能性表达提供了理想的试验体系，在林木人工种子育苗、濒危植物挽救等方面具有重要意义[1]。栎属植物是林木体细胞胚胎发生的研究热点之一。目前研究涉及的主要树种有十余种，研究较多的有欧洲栓皮栎(Quercussuber)[2-3]、夏栎(Quercusrobur)[4]、麻栎(Quercusacutissima)[5-6]、栓皮栎(Quercusvariabilis)[7]等，已在研究材料、培养技术等方面取得较大成功。

川滇高山栎(Quercusaquifolioides)作为西藏东南部、四川西部、云南西北部的特有树种，主要分布范围为海拔2 400～3 400 m，乔木高达30 m，但在干旱阳坡或遭受经常樵采后则退变成灌木丛林[8]。该树种适应性好，具有较强的抗环境干扰能力和旺盛的萌蘖能力以及优良的水土保持和水源涵养作用，是当地重要的造林树种。同时也具有较高的经济价值，其木材坚硬，树皮和坚果含单宁，可用于鞣制皮革、护肤、入药等，亦可作为生物能源和为食用菌生产提供原料。因川滇高山栎种子易受种实害虫侵害且不耐储藏，并且嫁接、扦插困难，目前主要依靠天然更新。前人对川滇高山栎的研究主要集中在形态结构、生理特征、生长特点、生物量、种群群落生态学等方面[9-15]，尚未见有关其体胚发生及组织培养方面的报道。为此，本研究以川滇高山栎未成熟合子胚为材料，研究基本培养基、植物生长调节剂配比、采样时期、培养条件、抗氧化剂等因素对川滇高山栎胚性细胞诱导的影响，以期为川滇高山栎优良无性系繁殖、基因保存、遗传改良等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

分别于2011-06-10、07-10、08-10、09-10从西藏林芝地区八一镇觉木沟川滇高山栎天然林的同一林分中采样，每次固定从胸径相当、彼此相距30 m左右的10棵树上，将前一年开花授粉所结的小坚果连同壳斗一起采下，用塑料袋分装带回实验室，保存于4 ℃的冰箱内备用。

1.2 川滇高山栎体胚诱导试验方法

1.2.1 外植体的消毒 接种前剥去川滇高山栎壳斗取出完整小坚果，先用自来水冲洗2～3 h，再用体积分数70%酒精消毒30 s，接着在1 g/L氯化汞溶液中消毒15～20 min，最后用无菌水冲洗3～5次。无菌条件下用解剖刀剥去果皮，取出种子，再剥去种皮后，胚根向下将全胚接种于培养基上。

1.2.2 基本培养基的筛选 以MS、1/2MS、B5和WPM为基本培养基，同时添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，以单因素对比试验筛选确定川滇高山栎胚性愈伤组织形成的最适基本培养基。

1.2.3 植物生长调节剂配比的筛选 以MS为基本培养基，设单独添加0，1，2，4 mg/L 6-BA和0，0.5，1.0 mg/L 2,4-D的处理以及二者按上述质量浓度两两配比的处理,观察川滇高山栎胚性愈伤组织的生长情况，以确定其最佳植物生长调节剂配比。

1.2.4 采样时期的筛选 将2011-06-10、07-10、08-10、09-10采集的来自于同一母树的川滇高山栎未成熟合子胚，接种于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培养基上进行培养观察，以确定其最佳采样时期。

1.2.5 培养条件的筛选 以MS为基本培养基，同时添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，接种川滇高山栎未成熟合子胚进行光暗培养条件的筛选。其中光照培养时光照周期为12 h/d、光照强度1 000～2 000 lx；暗培养时无光照，在培养瓶上覆黑布。观察光暗培养条件下胚性愈伤组织的生长情况。

1.2.6 抗氧化剂对褐变的抑制 所用培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，另附加0，0.5，1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以确定PVP最佳质量浓度。统计的褐变指标包括培养基中的褐变发生级别、褐变发生半径和褐变发生高度。褐变发生级别根据褐色的深浅，划分为无或很浅、中、深3级，分别用1、2、3表示；褐变发生半径为褐色区域的半径；褐变发生高度为褐色区域的竖直高度。

以上各项试验的所有处理均附加30 g/L蔗糖，4.5 g/L琼脂，pH值5.8，培养温度(25±2) ℃。除培养条件筛选试验的暗培养处理外，其余处理为防止褐变，均于接种后先暗培养3 d，然后置于光照周期12 h/d、光照强度1 000～2 000 lx的条件下培养。所有处理均接种10瓶，每瓶3个外植体，重复3次。

1.3 数据处理

采用Excel和SPSS13.0软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 基本培养基和培养条件对川滇高山栎体胚诱导的影响

由表1可知，将川滇高山栎未成熟胚分别接种于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS、1/2MS、B5和WPM培养基上，所有基本培养基上均有胚性愈伤组织及体胚产生。其中MS基本培养基在接种5 d后即能够产生乳白色体胚和愈伤组织(图1-A、B)，体胚诱导率明显较其他处理高；1/2 MS、B5和WPM培养基上产生的体胚个数较少，愈伤组织的量也较少，且颜色偏黄；另外，所有处理均有较严重的褐变现象发生。由表1还可知，光培养和暗培养2种培养条件下，川滇高山栎体胚诱导率有较明显变化，光培养条件下的诱导率较高，但褐变也较重，而暗培养时褐变较轻；与光培养条件相比，除B5外，其余基本培养基在暗培养条件下的体胚诱导率均显著降低。

表 1 基本培养基和培养条件对川滇高山栎体胚诱导的影响

图1 川滇高山栎体胚的发生过程

2.2 植物生长调节剂配比对川滇高山栎体胚诱导的影响

以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的2,4-D、6-BA及二者的组合，研究各处理对川滇高山栎胚性愈伤组织诱导的影响，结果见表2。从表2可以看出，不添加植物生长调节剂的MS培养基也能诱导出愈伤组织，但诱导率较低，添加植物生长调节剂则可提高川滇高山栎未成熟胚的诱导率。培养基中只添加6-BA时，不同质量浓度6-BA所对应的诱导率存在差异，其中当6-BA质量浓度为1 mg/L时，诱导率为36.7%，且愈伤组织量较多。培养基中只添加不同质量浓度的2,4-D时，所对应的诱导率差异明显，其中2,4-D质量浓度为1.0 mg/L时，诱导率为36.7%。 6-BA与2,4-D配合使用时，未成熟胚的诱导率较高，愈伤组织量也相应增加，诱导过程中原胚经历了球形期、心形期、鱼雷期和子叶期等发育时期(图1-C、D、E、F)；当1 mg/L 6-BA 与0.5 mg/L 2,4-D配合使用时，诱导效果显著提高，诱导率高达83.3%，且愈伤组织量最多。值得注意的是，所有植物生长调节剂处理的褐变率均较高。

表 2 2,4-D与6-BA不同质量浓度配比对川滇高山栎体胚诱导的影响

2.3 采样时期对川滇高山栎体胚诱导的影响

将不同时期采集于同一母树的川滇高山栎未成熟合子胚统一接种于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培养基中，研究采样时期对川滇高山栎胚性愈伤组织诱导的影响，结果见图2。从图2可以看出，川滇高山栎未成熟合子胚的采样时期对胚性愈伤组织诱导的影响较大，以08-10采集的合子胚愈伤组织诱导率较其他采样时期高，可产生大量白色透明或半透明的颗粒状愈伤组织；06-10采集的合子胚初代培养20 d后出现少量胚性愈伤组织；07-10、08-10采集的合子胚在接种5 d后即有颗粒状愈伤组织形成，15 d后大量发生，08-10采集的合子胚褐变率较07-10的低；09-10采集的合子胚褐变率明显增加，且愈伤组织诱导率急剧降低。

图2 采样时期对川滇高山栎体胚诱导的影响

2.4 PVP对川滇高山栎体胚诱导中褐变的抑制作用

褐变在川滇高山栎体胚诱导中发生较严重，为寻找有效减轻褐变的措施，在培养基中添加了不同质量浓度的抗氧化剂PVP，观察其对褐变的抑制作用。由表3可知，不同质量浓度PVP对控制褐变具有一定作用，在本试验过程中，PVP质量浓度越高抑制效果越好，当PVP为1.0 g/L时，所有褐变发生指标均明显降低；同时随着褐变减轻，产生的愈伤组织量有所增加。

表 3 PVP对川滇高山栎体胚诱导中褐变的抑制作用

3 讨 论

本研究结果表明，基本培养基、植物生长调节剂配比、采样时期、培养条件等均会对川滇高山栎体胚发生产生影响。栎属植物体胚诱导大多以MS或WPM为基本培养基[16-17]，本试验采用的4种基本培养基中，MS较其他培养基更有利于川滇高山栎体胚的发生，可见，无机盐含量高、微量元素齐全的MS培养基，除对栓皮栎外[18]，对川滇高山栎幼胚的体胚发生也是有利的。

栎属植物体胚诱导时，植物生长调节剂以细胞分裂素和生长素为主，一般两者配合使用，生长素与细胞分裂素在植物体胚诱导中起着决定性作用[19-21]。降低或去掉生长素能提高体胚发生的诱导效果[22]。以川滇高山栎未成熟合子胚为外植体诱导体胚发生时，不同配比的6-BA和2，4-D均能诱导体胚发生，但诱导效果存在较大差异，本试验中以1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D的配比诱导效果较好。不同发育时期的未成熟合子胚因其分化程度存在差异，诱导率也各不相同，生长在西藏林芝地区八一镇的川滇高山栎以08-10左右采集的未成熟合子胚诱导率较高。

光照在体胚发生中具有较为重要的作用。栎属植物不同种在体胚发生中对光照的要求有较大差异，如夏栎(Q.robur)的合子胚在暗培养条件下诱导率较高[23]，麻栎(Q.acutissima)和欧洲栓皮栎(Q.suber)的合子胚则在每天16 h光照条件下培养体胚的诱导率较高[24-25]，而红栎(Q.rubra)在持续光照条件下具有较高的体胚诱导率[26]。本研究中，川滇高山栎未成熟合子胚在光照和暗培养条件下均能诱导体胚发生，但光照条件下诱导率较高。

木本植物组织培养过程中褐化现象严重，材料中总酚含量与褐化程度呈正相关，这类褐色物质在培养基中不断扩散，抑制其他酶的活性，毒害培养材料，甚至导致其死亡，严重影响组织的生长。本研究在培养基中添加抗氧化剂PVP能减缓褐化、促进组织生长；另在操作过程中应尽量减少机械损伤，以防止褐变。

本研究以川滇高山栎未成熟合子胚为外植体，初步建立了川滇高山栎体胚诱导体系，但要真正实现从体胚诱导、体胚增殖、体胚成熟、体胚萌发以及最终的试管苗的移栽，仍有许多工作需要进一步研究完善。

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