基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

周 鹏，池 青，吕金洋，刘香利，赵惠贤

(1 旱区作物逆境分子生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；2 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

近些年来，由于温室效应的影响，全球的气候逐渐变暖，人们忽略了冻害对农作物的影响，但是全球变暖并不意味着不会发生农作物的低温冻害，全球变暖同时伴随着的是极端气候和天气事件发生概率的增加，2008年的冬季发生在我国大面积的冻害就直接造成国家种植业经济损失670亿元[1]。随着弱冬性小麦种植面积不断扩大，冻害已经成为制约弱冬性小麦种植面积扩大和产量增加的主要自然灾害之一。目前常规的防止小麦低温冻害的措施主要有：选择优良的耐寒品种、控制播种时期和数量、肥水调控、幼苗抗寒锻炼以及采用化学调控技术等[2]。其中，选择优良的耐寒品种是提高弱冬性小麦生产的最经济有效的途径。然而，利用常规育种方法培育耐寒小麦品种不仅周期长，而且很难使小麦抗寒能力有很大提高。随着功能基因研究的飞速发展，使得利用基因工程技术直接将目标性状基因转入受体小麦进行品种定向改良得以实现，并且将逐渐成为常规育种的一种有效补充途径。目前，对小麦进行定向改良的转基因技术主要包括基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法。利用这些技术已经成功获得抗病[3-5]、抗虫[6-7]、抗逆[8]、品质改良[9-10]、产量提高[11-12]等小麦转基因植株，其中应用较多的是抗病和品质改良。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)等与植物的抗冻性密切相关，其中在小麦体内起主要作用的是SOD和APX[13-14]。目前，通过转基因育种的方法已经成功将一些具有抗冻功能基因转入到植物体内，并且使植物的抗冻性有一定程度提高。Georges等[15]将人工合成的黄盖鲽鱼抗冻蛋白基因成功导入到玉米的原生质体内，并且在植物的细胞中获得了表达。Fan等[16]将从胡萝卜幼苗中克隆到的一个抗冻蛋白基因(AFP)转入到烟草中，发现在0 ℃的条件下，转基因烟草受到的冻害明显小于非转基因烟草。Parvanova等[17]将拟南芥中脯氨酸合成相关的吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因成功转入到烟草中，经过-2 ℃低温处理24 h后，转基因植株存活而对照植株死亡。Mckersie等[18]从烟草中克隆了编码SOD的cDNA，并将其转入苜蓿体内，使转基因植株的抗冻性有明显提高。郭北海等[19]从榆钱菠菜中克隆出编码甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的cDNA,并将其转入小麦品种石90-4185中；Zhang等[20]对上述郭北海等获得的转基因小麦植株进行抗冻性检测，发现转基因植株体的抗冻性明显高于对照植株。KN2基因是从南极鱼中克隆的一个编码超氧化物歧化酶的基因，该基因可能具有增强生物体抗冻性的功能，但有关KN2基因提高作物抗寒性的研究尚未见报道。

小偃22是西北农林科技大学李璋研究员以小偃6号×775-1的杂种F1代作母本，小偃107作父本，经过复核杂交、系统选育而成的弱冬性小麦品种，该品种具有高产、稳产、优质、抗病等优点，适宜于陕西关中新老灌区水肥条件较好的地块及塬区旱肥地种植，也适宜在黄淮麦区同类生态条件的地区种植。小偃22的耐寒能力相对较弱，这成为其北移扩大种植面积的限制条件。本研究采用基因枪介导的共转化法，将KN2基因和筛选标记基因bar共转化到弱冬性小麦品种小偃22中，通过除草剂筛选，获得含有目的基因KN2的转基因小麦植株，为进一步研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用，以及利用基因技术提高小麦抗逆性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和载体质粒

选用黄淮麦区大面积推广的弱冬性小麦品种小偃22为供试材料。供试材料于2011～2012年度种植在西北农林科技大学小麦试验田，田间正常管理。

共转化所用载体质粒分别为含有目标基因KN2的载体质粒pUBI::KN2和含有筛选标记基因bar的载体质粒pUBI::bar，结构见图1，均由中国科学院遗传与发育研究所王道文研究员提供。

图1 载体质粒pUBI::KN2和pUBI::bar的结构UBI promoter.玉米泛素基因启动子;KN2.南极鱼的超氧化物歧化酶基因;bar.筛选标记基因，通过编码膦丝菌素乙酰转移酶来降低膦丝菌素的毒性;Nos.终止子

1.2 小麦的遗传转化和转基因植株的获得

采收小偃22授粉后10 d的未成熟种子，用0.1%升汞消毒后剥取幼胚，将其盾片朝上接种于MS诱导培养基(MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)，25 ℃暗培养7 d后，将愈伤组织转入高渗培养基(MS+0.4 mol/L 甘露醇+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)上高渗培养6 h，然后采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪进行轰击(金粉浓度为120 μg/枪，2种质粒浓度比为1∶1，均为1.0 μg/枪，轰击压力为7.584 MPa，真空度为27～28 Pa，轰击距离为9 cm)，轰击后的愈伤组织于高渗培养基上继续培养16 h，再转移到MS诱导培养基上恢复培养7 d，恢复培养后的愈伤组织转移至分化筛选培养基(MS+1.5 mg/L KT+0.05 mg/L NAA+4.0 mg/L PPT)上，25 ℃光照条件下培养，每2周更换1次培养基,将分化出的小苗转移至生根培养基(1/2MS+0.2 mg/L NAA)，待苗高为4～5 cm时移至春化间春化40 d，苗高为7～8 cm时将根系发达的分化苗移栽到培养钵(直径30 cm，高度50 cm)中，于温室生长。

1.3 转基因小麦植株的PCR检测

取转基因小麦植株幼嫩叶片，采用CTAB法[21]提取基因组DNA，进行PCR扩增。根据目的基因序列，采用Primer5.0软件设计引物，KN2基因的上游引物为：5′-AGCCCCTGTGACGCTGAC-3′，下游引物为：5′-GCGATGCCGATGACTCCA-3′,扩增片段大小为396 bp。bar基因的上游引物为：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′,下游引物为：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3′,扩增片段大小为433 bp。PCR扩增体系总体积为20 μL：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物(稀释成10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 U (TianGen公司)，模板DNA约200 ng，补ddH2O至20 μL。KN2扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃复性 30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。bar扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。以小偃22非转基因植株作为阴性对照，以ddH2O作为空白对照，将扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 转KN2基因小麦植株的获得

以小偃22为转化受体，共接种2 000个幼胚诱导产生愈伤组织，7 d后产生的愈伤组织数为1 943个，愈伤诱导率为97.15 %；转移至高渗培养基上的愈伤组织数为1 680个；基因枪轰击后的愈伤组织经过恢复培养和筛选分化，共获得再生植株17株，移栽到培养钵中后成活15株，成活率为88.2%(图2)。

图2 小偃22 转KN2基因的再生植株

2.2 转KN2基因小麦植株的PCR鉴定

将再生植株幼苗移栽到培养钵在温室培养，取转基因小麦植株幼嫩叶片提取基因组DNA进行PCR检测。经过多次PCR检测，非转基因植株(阴性对照)和ddH2O(空白对照)均没有扩增产物，15株再生植株中仅有6株(7号、10～14号再生植株)扩增到与阳性质粒pUBI::bar大小一致的433 bp的目标片段(图3-A)，表明获得了6株转bar基因的阳性植株，bar基因转化率为0.36%(6/1 680)；15株再生植株中仅有4株(7号、11～13号再生植株)扩增到与阳性质粒pUBI::KN2大小一致的396 bp的目标片段基因(图3-B)，表明获得了4株转KN2的阳性植株，KN2的转化率为 0.24%(4/1 680)； 7号、11～13号再生植株同时转入了bar和KN2，共转化率为 0.24%。

图3 小偃22共转化植株bar特异PCR(A)和KN2特异PCR(B)检测结果

3 讨 论

在转基因研究中广泛使用除草剂或者抗生素基因作为筛选标记基因，可以从大量的非转化细胞中筛选出相对较少的转化细胞，进而减轻后续试验的工作量[22]。但是以此为筛选标记基因获得转基因植株后筛选标记基因的存在就是多余的，甚至是有害的，并且对筛选标记基因进行安全评估要耗费大量的人力和财力，而且结果还不易被广大消费者接受[23]。基因枪介导的共转化法由于操作简单，并且通过后代的自交分离能够去除筛选标记基因，因此，该方法成为最常用的获得无筛选标记的转基因植物的方法。应用该方法已经成功获得了水稻[24]、玉米[25]和苜蓿[26]等作物的无筛选标记基因的植株。刘永伟等[27]采用基因枪共转化的方法成功将病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17导入扬麦12和扬麦16中，扬麦12为受体的转化率分别为1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17)，扬麦16为受体的转化率分别为2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。周淼平等[22]同样采用基因枪共转化的方法，将拟南芥DREB2A基因和bar基因导入到小麦品种Alondra和扬麦12中，Alondra为受体的转化率分别为2.4%(bar)、0.2%(AtDREB2A)和0.1%(bar+AtDREB2A)，扬麦12为受体的转化率分别为2.4%(bar)、0.6%(AtDREB2A)和0.2%(bar+AtDREB2A)。本研究利用基因枪介导的共转化法,将筛选标记基因bar与目的基因KN2转入小麦品种小偃22中，旨在获得含有目的基因的转基因植株，通过后代自交分离得到只含有目的基因的转基因植株，bar的转化率为0.36%，KN2的转化率为 0.24%，bar和KN2的共转化率为0.24%。这些转基因小麦研究报道的遗传转化率均不相同，其主要原因之一可能是受体品种不同所致。

冻害是弱冬性小麦种植面积扩大的最大限制因素。超氧化物歧化酶(SOD)能够清除细胞内的活性氧，防止活性氧积累对膜造成的破坏，进而保护细胞的膜系统。本研究采用基因枪法，将南极鱼体内编码超氧化物歧化酶的基因KN2和筛选标记基因bar共转化到小麦品种小偃22中，通过多次PCR检测筛选获得了4株同时含有KN2和bar基因的转基因小麦；这些转基因小麦的目标基因是否能稳定遗传，以及转基因植株的抗寒性是否比非转基因植株有所提高，还有待对这4株转基因植株进行后代追踪检测，进一步通过转KN2和bar基因植株后代自交分离剔除bar基因，最终筛选获得含有KN2基因的安全转基因小麦植株，进一步研究转KN2基因的小偃22的抗寒性变化。

志谢：感谢中国科学院遗传与发育研究所王道文研究员为本研究提供了载体质粒！

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