株龄、栽培环境及温度对甘蓝小孢子诱导出胚的影响

张恩慧，程芳芳，杨安平，程永安，许忠民，马青山

(1 西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100；2 杨凌职业技术学院 生物工程系，陕西 杨凌 712100)

甘蓝是十字花科中一种重要的蔬菜作物。甘蓝小孢子培养是指利用花粉细胞的全能性，在特定的培养基上诱导培养花粉小孢子，促其发育成单倍体或双单倍体植株的一种育种技术。该技术近年来在国内外均有研究报道[1-5]，但小孢子诱导胚产量低和出胚材料基因型范围窄等诸多问题，严重地制约着甘蓝单倍体育种的进程。据研究报道，甘蓝小孢子诱导胚产量低受基因型、培养条件、糖浓度、花粉发育时期等诸多因素的影响[6-11]，但有关小孢子供体甘蓝生长环境温度或株龄影响的研究尚未见报道。同时，研究证实，植物的生长温度是小孢子培养成败的决定性因素，而且甘蓝株龄、栽培环境在一定程度上影响甘蓝花蕾的发育程度，进而影响到小孢子培养的效率[12-13]。为此，本研究以12个甘蓝品种为试材，分析株龄、栽培环境及温度对甘蓝小孢子诱导出胚的影响，旨在为提高甘蓝小孢子胚产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为Q2、Q4、Q5、碧实绿、万福、绿球66、将军、QG65、F1-03、翠宝、HP57和HP20等12个甘蓝品种，均由西北农林科技大学园艺学院甘蓝育种和生物技术研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 不同株龄甘蓝植株的栽培 (1)成株栽培。2011-07-10将具有6片真叶的12种供试甘蓝苗定植于大田，于12-06将已结球紧实的植株带根挖起移植于地窖假植越冬，翌年03-10取出移栽到露地纱网棚或温室内培养至抽薹显蕾。

(2)半成株栽培。2011-08-25将12种供试甘蓝露地播种育苗，09-28定植田间，冬前植株进入包球初期露地越冬，翌年03-20在半成株田上搭建纱网棚或与成株一起移栽到温室，培养至抽薹显蕾。

1.2.2 游离小孢子出胚诱导 在已抽薹的甘蓝植株上，选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾，游离出小孢子。参照朱守亮等[14]和杨安平等[15]的研究成果，将洗液B5培养基中的蔗糖质量分数设为14%，小孢子热激培养和诱导培养的培养基NLN中的蔗糖质量分数设为17%与14%，转速为1 500 r/min，进行游离小孢子的出胚诱导。

1.2.3 不同株龄甘蓝上花蕾小孢子出胚的比较 以Q2、Q4和Q5 3个甘蓝品种为试材，分别选取露地纱网棚内成株和半成株上的4.0～5.8 mm花蕾，倒置显微镜下观察确定小孢子发育时期，然后诱导培养小孢子，比较不同株龄甘蓝上花蕾发育同步性和胚产量。花蕾发育同步性是指相同长度的花蕾中小孢子所处的单核靠边期的一致性。依据单核靠边期小孢子所占比例(A)，将其评判为很差(A≤65%)、较差(65%75%)4个层次。胚产量=胚状体数/花蕾数(下同)。

1.2.4 温室和露地栽培甘蓝花蕾小孢子出胚的比较 越冬后，选取供试12个甘蓝品种的成株，分2部分分别栽植于温室和露地纱网棚；抽薹显蕾后至花蕾生长到4.0～5.8 mm时选摘，并游离出小孢子诱导培养，比较露地和温室2种环境条件下花蕾小孢子的胚产量。

1.2.5 温度对甘蓝小孢子出胚的影响 选用在地窖中通过低温春化的甘蓝品种Q4成株为试材，将其栽植于加温温室中，当植株抽薹显蕾后，在采蕾前2 d的中午，将温室内温度设定为24，28(CK)，32 ℃，培养植株花蕾生长，于第3天上午10：00选采4.0～5.8 mm花蕾，培养小孢子出胚，比较温度对甘蓝花蕾小孢子胚产量的影响。

2 结果与分析

2.1 株龄对甘蓝小孢子出胚的影响

由图1及表1可以看出，供试Q2、Q4和Q5 3个甘蓝品种的成株抽薹显蕾时间较晚，植株生长势弱，相同长度花蕾的小孢子单核靠边期同步性较差；适宜花蕾的持续取样时间为11～13 d，其小孢子诱导胚产量为7.2～11.6胚/蕾。3个甘蓝品种的半成株抽薹显蕾时间均较早，植株花枝健壮，花蕾饱满、小孢子发育同步性很好，适宜花蕾的持续取样时间达14～18 d，其小孢子诱导胚产量为16.8～30.3胚/蕾。这些结果表明，甘蓝半成株上的花蕾品质优于成株花蕾，其花蕾小孢子诱导胚产量比成株高9.6～18.7胚/蕾。经方差分析可知，除Q2和Q5成株的小孢子诱导胚产量无显著差异外，其余处理的胚产量均存在极显著差异，且半成株的胚产量极显著高于成株。由此可见，甘蓝半成株上花蕾比成株上花蕾更易诱导出胚状体。

表 1 株龄对甘蓝小孢子出胚的影响

2.2 栽培环境对甘蓝小孢子岀胚的影响

由表2可以看出，在露地和温室2种环境下生长的12个甘蓝品种，除HP20、HP57和翠宝外，其他9个品种的胚产量均表现为温室栽培高于露地栽培，差值为0.69～15.16胚/蕾，且除碧实绿外，其余8个甘蓝品种在温室与露地的小孢子胚产量均存在极显著差异。F1-03在温室中的胚产量为2.37胚/蕾，露地中未见出胚。由此可见，温室栽培的甘蓝更有利于小孢子诱导出胚。

2.3 温度对甘蓝小孢子出胚的影响

小孢子供体植株生长的环境温度对小孢子的发育起着重要作用，温度过低或过高都会导致小孢子发育不正常，从而影响小孢子的出胚情况。由图2及表3可以看出，24或32 ℃处理2 d的甘蓝Q4花蕾小孢子发育同步性差，适宜诱导培养的花蕾长度为5.1～5.6 mm或4.5～4.8 mm；其小孢子诱导的胚产量均较少，分别为11.8和23.2胚/蕾。而28 ℃处理2 d后，Q4品种花蕾小孢子发育同步性最好，花蕾适宜长度为4.9～5.1 mm，最大值和最小值仅相差0.2 mm；其小孢子诱导出胚数最多，胚产量高达31.1胚/蕾，显著高于其他2个处理。由此可见，28 ℃环境温度下培养的甘蓝花蕾易游离出小孢子，有利于提高胚产量。

表 2 栽培环境对甘蓝小孢子岀胚的影响

图2 不同环境温度下甘蓝Q4小孢子诱导出胚的效果

表 3 环境温度对甘蓝Q4小孢子诱导出胚的影响

3 结论与讨论

本研究结果表明，甘蓝成株和半成株均能作为游离小孢子的供体植株，且以半成株花蕾品质较好，表现为花蕾小孢子发育同步性高，胚产量达到16.8～30.3胚/蕾，比成株高9.6～18.7胚/蕾。成株和半成株的胚产量会有如此差异，是因为甘蓝植株的生长和发育状况会直接影响花蕾中小孢子的生长发育效果。一般而言，甘蓝成株已完全完成营养生长，转入生殖期会因营养期过长导致植株早衰，这可能引起花蕾小孢子发育同步性差、生长势弱，并导致其小孢子产胚率低。

本研究发现，甘蓝植株生长在温室更易获得小孢子胚，其胚产量比露地栽培增加0.69～15.16 胚/蕾，这与花椰菜[13]的表现一致。这是因为，甘蓝抽薹植株生长在相对恒定的栽培环境条件下，受外界自然因素如温度、湿度等影响较小，其植株生长健壮、生殖旺盛，花蕾小孢子生长发育同步性高，有利于小孢子培养，提高胚产量。

综上所述，甘蓝半成株较成株适宜作为游离小孢子培养的花蕾供体；甘蓝花蕾供体植株栽培于28 ℃温室中，花蕾小孢子诱导产生的胚状体数多，胚产量高达31.1胚/蕾。

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