提高放线菌次级代谢产物产量方法的研究进展

雷秀清 李力 黄建忠

（福建师范大学生命科学学院 工业微生物教育部工程研究中心 福建省现代发酵技术工程研究中心，福州 350108）

微生物能够产生多种具有生物活性的天然次级代谢产物，已发现的大部分的活性天然次级代谢产物来自放线菌。放线菌次级代谢产物从结构上分为：β-内酰胺类、多肽类、糖肽类、核苷类及聚酮类化合物等［1-5］，这些物质具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制剂和免疫激活剂等的功效，被广泛地应用于医药业、农业、兽业、食品工业等领域［6］。其中，研究较多的是聚酮类化合物，主要包括大环内酯类、四环素类和多烯类等［7，8］。聚酮类化合物是聚酮合成酶（Polyketide synthase，PKS）催化形成的，其合成途径与脂肪酸长链的合成相类似，催化合成聚酮相应化合物主体骨架结构的酶为聚酮合成酶［9］。根据聚酮合成酶的结构和作用模式的不同分为3 类：Ⅰ型 PKS，Ⅱ型 PKS 和Ⅲ型 PKS。Ⅰ型 PKS 又可分为模块式和迭代式，模块式即每个模块的蛋白有不同的结构域，且结构域的激活位点只使用一次，主要参与细菌聚酮的合成，而迭代式即一个蛋白一个结构域，且这个结构域可以被重复使用，主要在真菌中［10］；Ⅱ型 PKS 是具有不同催化功能的酶复合体，重复催化多次反应来合成聚酮化合物，这类聚酮合酶主要在细菌类中［11］；Ⅲ型 PKS与前两者不同的是不依赖ACP 直接利用酮基合成酶（ketosynthase，KS）催化泛酰辅酶A 之间的缩合，重复利用KS 催化合成一系列结构复杂的聚酮类化合物，主要在真菌中［12］。

伴随着多耐药性、强耐药性病原菌的不断出现，从自然界中分离到的菌株活性产物产量不高，不足以满足实际需求。如何寻找新药以及提高微生物次级代谢产物产量成为首要任务。传统的“诱变-筛选”到更具目的性方向性的基因技术，第二代和第三代DNA 测序技术带来的技术革新，成为解决上述问题的重要手段。已发表的菌株基因组序列分析结果显示，基因组中存在大量沉默或者隐性的次级代谢产物生物合成基因簇，即这些基因簇在试验条件下未得到表达或者表达量低［13，14］。通过基因技术改造菌株使低产菌株变高产，以及激活沉默的生物合成基因簇，为寻找新药和提高次级代谢产物提供相应技术的参考。

本文结合目前提高次级代谢产物产量的方法、新抗生素的研究成果，尤其是聚酮化合物方面的研究，主要在调节基因及基因簇的表达、核糖体相关蛋白基因的突变和异源表达等3 个方面进行概述。

1 调节基因及基因簇的表达

在自然界中，一株放线菌往往产生多种抗生素，有的产物还存在多条分支代谢途径，调节子存在多级层调控，多种代谢产物共同竞争同一种前体［15］。放线菌的次级代谢产物生物合成基因簇成簇串联在一起，且绝大多数的基因簇转录水平受各种调节因子的控制，途径特异性调节子的调节最为直接［16］。通过调控途径特异性正调节子的过表达，负调节子的敲除，基因簇加倍表达提高次级代谢产物产量［10］。

1.1 过表达正调节子

纳他霉素也叫匹马霉素（Pimaricin），是由Streptomyces natalensis 合成的26 元环多烯大环内酯类抗生素，能抑制酵母和霉菌的生长，广泛应用于食品业的防腐防霉，延长货架期限［5］。Antón 等［17，18］发现合成Pimaricin 的基因簇中有两个正调节子PimR 和PimM；Jang 等［19］构建pimM 和pimR 过表达突变株，发酵结果显示，pimM 过表达的突变株在液体培养基中Pimaricin 产量为200 mg/L，野生型和pimR 过表达的突变株产量均为80 mg/L，说明pimM比pimR 对纳他霉素的产量影响大。这可能是两个调节子的调控级层的不同，pimR 调控pimM 的表达，而pimM 调控整个pimaricin 基因簇基因的表达［20］。Streptomyces ambofaciens 产生的次级代谢产物已知的有两种：螺旋霉素（Spiramycin）［21］和纺锤菌素（Congocidine）［22］，利用生物信息学分析其染色体组结果发现，S. ambofaciens 染色体上存在许多隐性的可能合成次级代谢产物的生物合成基因簇，其中有个大型的Ⅰ型PKS 基因簇推测可能编码一个目前最大的聚酮化合物［14］。Lusia 等［14］对该基因簇进行克隆并进行RT-PCR 分析，结果显示该基因簇未得到转录表达。为激活该基因簇表达，过表达该基因簇内一个可能是转录激活子的调节基因sanmR0484，该基因编码的蛋白与LAL（ Large ATP binding of the LuxR）家族相似。结果在发酵液中检测到一类51 元环的糖基化大环内酯stambomycins A-D，生物活性测定显示新的化合物Stambomycins 抗革兰氏阳性菌不抗真菌及革兰氏阴性菌，比较特别的是还具有抗人体肿瘤细胞繁殖的生物活性。

1.2 敲除负调节因子

基因敲除对合成次级代谢产物起到抑制作用的调节子，可以提高生物合成基因簇的转录与表达水平，最终目的产物产量得到提高。Streptomyces platensis MA7327 产平板霉素（Platensimycin）［23］和平板素（Platencin）［24］，两抗生素产量都很低产量只有1-3 mg/L。平板霉素和平板素是可抑制细菌脂肪酸形成的一类新光谱抑菌抗生素，包括抑制耐甲氧西林金色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌［23］。在合成平板霉素和平板素的基因簇中发现ptmR1 基因编码GntR 家族类似的转录抑制子，基因敲除ptmR1基因，产生的突变株S. platensis SB12001 platencin 产量为255±30 mg/L，突变株S. platensis SB12002 platensimycin 产量为323±29 mg/L。两突变株产量都显著提高，比野生型菌株产量高100 倍［25］。

1.3 过表达与基因敲除相结合

力达霉素C-1027 是Streptomyces globisporus C-1027 产生的一种新型抗肿瘤抗生素，有一个由聚酮合酶合成的烯二炔结构的九元环，在医学临床上C-1027 其抗肿瘤活性比阿霉素高，已进入临床二期试验［26］。C-1027 基因簇中发现4 个调节子：生物信息学分析SgcR3 与泰乐菌素正调控子TylR 的调控子类似；SgcR2 属于AraC/XylS 转录激活子家族；SgcR1 与StrR 调节子类似，StrR 是转录激活子；SgcR 可能编码DNA 结合蛋白，是负调节子。分别过表达sgcR3、sgcR2、sgcR1 正调节子基因，突变株C-1027 的产量都有显著提高，野生型C-1027 产量为5.5 mg/L，其中过表达sgcR1 基因的突变株C-1027产量最高为19.6±2.2 mg/L［27］。基因敲除sgcR 突变株C-1027 产量高达17.4±1.6 mg/L，在敲除sgcR的突变株的基础上过表达正调节因子基因sgcR1，C-1027 的产量进一步提高，比野生型高7 倍，达到37.5±7.7 mg/L［28］。

1.4 加倍基因簇

研究人员［29］在卡那霉素高产菌株的染色体组内发现多拷贝的卡那霉素生物合成基因簇，由此可见加倍次级代谢产物生物合成基因簇拷贝数亦可以提高产量。Murakami 等［30］构建一个含有ZouA（编码TraA 型蛋白，负责接合转移），RsA 和RsB（类似于oriT）定点重组系统，能将大片段的基因簇成串的整合到宿主染色体上并表达。以模式菌株S. coelicolor 的 放 线 紫 红 素（Actinorhodin，ACT）基因簇ACT 为例用该重组系统增加ACT 拷贝数，S. coelicolor 突变株基因组分析发现，基因组中平均整合9 个拷贝数的ACT 基因簇，突变株的ACT 的产量为400 mg/L，野生型约为20 mg/L，突变株产量提高20 倍。尼可霉素（Nikkomycins）是核苷类抗生素，具有抗真菌、杀螨虫等生物活性，对于人类和哺乳动物无毒性，被认为是较理想的一种抗生素。Liao等［31］利用Red/ET 整合技术使nikkomycin 完整基因簇在链霉菌Streptomyces ansochromogenes 的染色体组上加倍，发酵结果显示nikkomycin X 和nikkomycin Z的产量都得到不同程度的提高，nikkomycin X 从220 mg/L 提高到880 mg/L，nikkomycin Z 从120 mg/L 提高到210 mg/L。氧四环素Oxytetracycline 是光谱抗菌抗生素，由Ⅱ型PKS 催化合成，最小PKS 负责合成19 碳单位长链。以Streptomyces nimosus M4018和工业菌株SR16 为例，为提高氧四环素产量，加倍两原始菌株染色体上minimal PKS 拷贝数，突变株MR69 氧四环素的产量比M4018 增加51.2%，达369.9 mg/L；突变株SR903 与SR16 相比，氧四环素产量提高32.9 %，达到1 309.4 mg/L［32］。

2 核糖体相关蛋白基因的诱变

核糖体工程是用于发掘新产物、激活沉默基因簇表达的手段，即使核糖体相关蛋白（包括核糖体蛋白S12 或者RNA 聚合酶）发生基因突变赋予抗性，微生物基因转录和翻译表达水平得到提高的技术［13，33］。通常突变发生在rpoB 基因（编码RNA 聚合酶β 亚基）和rpsL 基因（编码核糖体蛋白S12）上［33］。

2.1 rpoB基因突变

S. lividans 66 拥有完整的放线紫红素（ACT）和灵菌红素（Undecylprodigiosin，RED）基因簇，通常不产放线紫红素和灵菌红素。S. lividans 66 用利福平抗生素进行诱变，编码RNA 聚合酶β 亚基的rpoB基因发生点突变，产生抗利福平的突变株合成ACT和RED［34］。rpoB 基因发生点突变后，RNA 聚合酶能模仿与ppGpp 结合的形式，增加与次级代谢产物启动子区域亲和力，激活次级代谢产物的合成［13］。

2.2 rpsL基因突变

新发现的一株S. lividans TK24 在正常情况下产大量的ACT，经基因分析发现S. lividans TK24 有链霉素（Str）抗性基因的突变，突变点发生在编码核糖体蛋白S12 的rpsL 基因上（K88E），激活ACT 的合成［35］。S. coelicolor 的基因rpsL 发生突变，突变株K88E ACT 的产量增加［35］。在S. coelicolor A3（2）用积累浓度诱变中发现，突变株核糖体蛋白S12 有新的突变位点，在核糖体蛋白S12 92 位插入一个甘氨酸残基，突变株GI92 赋于paromomycin（巴尤霉素）抗性，在三突变株SGR K88E 基础上引入GI92 突变，显著的提高了ACT 的产量（K88E OD640/450=0.8，K88E GI92 OD640/450=1.7）［36］。

2.3 累加突变

核糖体蛋白的突变不断增加，可以提高抗生素产量。S. coelicolor 引入3 个药物抗性突变SGR 逐步的提高了ACT 的产量［37］。Wang 等［38］在三突变株SGR 基础上引入突变，其中发生7 个和8 个突变的突变株C7、C8 分别产ACT 0.51 g/L 和0.55 g/L，与野生型S. coelicolor 1147（ACT 产量5.8 mg/L）相比，产量分别提高88 和95 倍。在GYM33 培养基上培养，C7 和C8 分别产ACT 1.63 g/L 和1.22 g/L，与ACT 产量为9 mg/L 的野生型相比，产量分别提高180 倍和136 倍。

3 异源表达

随着基因测序技术的不断发展，基因组测序变得方便快捷。已发表的链霉菌基因组序列分析结果发现，每株菌不止产一种次级代谢产物，除了一些主要的抗生素基因簇有表达之外，还有许多沉默的基因簇未得到表达，或者转录水平低未被检测到［33］。由于某些野生型本身性质的限制以及复杂的代谢网络，中间产物复杂不稳定或者终产物表达量低，限制了在体内研究抗生素合成途径［39］。构建背景清晰的易操作的异源表达的宿主，有利于发掘与研究新抗生素。较为常用并容易进行基因操作的异源表达宿主有S. coelicolor、S. avermitilis、S. lividans 等［39-41］。

3.1 Streptomyces coelicolor

S. coelicolor 产多种抗生素其中4 种：由Type II PKS 合成的ACT，由非核糖体多肽合成酶（NRPS）和PKS 杂合作用合成的RED，由NRPS 合成的钙依赖抗生素（Calcium-dependent antibiotic，CDA）和Type I PKS 合成的coelimycin（CPK）［42］。Gomez-Escribano 等［43］在Streptomyces coelicolor M145 基 础 上删除以上4 个大的基因簇，并对核糖体蛋白S12 以及RNA 聚合酶β 亚基进行定点突变，构建了系列异源表达宿主。来自S. venezuelae 的氯霉素（Chloramphenicol）生物合成基因簇和来自S. ambofaciens ATCC23877 的 纺 锤 菌 素（Congocidine） 生 物 合成基因簇及S. coelicolor M145 自身的放线紫红素（Actinorhodin）生物合成基因簇分别在S. coelicolor系列改造宿主中表达。HPLC 检测发酵产物，结果表明在含有一个rpoB 突变的S. coelicolor M1154 以及含有rpoB 和rpsL 双突变的S. coelicolor M1152 宿主中表达的发酵产物色谱峰比较单一，背景清晰。还有研究人员［44］将S. coelicolor 的线性染色体的两个臂、所有的PKS、NRPS 基因以及900 kb 的亚着丝粒端一起敲除，缩小基因组大小，构建一系列突变宿主。ACT 基因簇导入不同突变宿主中表达，筛选能表达ACT 且产量有提高的异源表达宿主突变株。只有几株突变株能表达ACT，其中突变株ZM10ACT，ZM11ACT 产量比野生型M145T 高，在OD640下检测放线紫红素产量，M145T ACT 的OD640值为0.07，ZM10ACT ACT 的OD640值 为0.3，ZM11ACT ACT 的OD640值为0.15。

3.2 Streptomyces avermitilis

Streptomyces avermitilis 是可高效表达阿维菌素的工业菌株。Komatsu 等［45］为了让S. avermitilis广泛应用于表达其他不同结构类型次级产物基因簇，对S. avermitilis 基因组进行缩小。将超过1.4 Mb 的内源基因通过同源重组逐步地从S. avermitilis 9.02 Mb 的线性染色体中敲除，产生不同基因缺失突变株。Komatsu 选择不同结构类型的生物合成基因簇验证S. avermitilis 突变株异源表达效果。S. avermitilis 野生型基因组中不含有氨基糖苷类抗生素的合成基因簇，Komatsu 等［45］将氨基糖苷类抗生素链霉素（Streptomycin）生物合成基因簇与整合质粒pKU465cos 连接形成质粒pSM1，pSM1 导入S. avermitilis 野生型及缺失最大片段的突变株SUKA4及SUKA5 中表达，突变株SUKA5（pSM1）的链霉素产量为200 μg/mL，比S. avermitilis（pSM1）（<100 μg/mL）及产链霉素的野生型S. griseus IFO13350（<50 μg/mL）高。S. avermitilis 基因组中至少有8 个不同的NRPS 生物合成基因簇，但产物中未检测到任何的多肽衍生物。Komatsu 等［45］选择由S. clavuligerus合成的β 内酰胺类抗生素头霉素（Cephamycin C）的生物合成基因簇在S. avermitilis 突变株中异源表达验证，S. avermitilis 的突变株可以利用NRPS 合成多肽化合物。结果接合子SUKA17（pCEF2）在SA 培养基上合成Cephamycin C，但产量比S. clavuligerus低。替换培养基并过表达ccaR 基因（负责激活Cephamycin C 生物合成基因簇表达），突变株Cephamycin C 的产量达130 μg/mL，比野生型S. clavuligerus（50 μg/mL）高。S. avermitilis 能合成工业水平的聚酮化合物，Komatsu 等［45］选择S. platensis Mer-11107 合成的大环内酯pladienolide 抗生素基因簇在S. avermitilis 突变株中表达。结果突变株SUKA5不表达pladienolide，过表达pladienolide 的转录激活子pldR 后，突变株合成pladienolide。结果表明，合成聚酮类化合物有时还需要结合调节因子的表达。S. avermitilis 由于缺乏单萜环化酶且操纵子被IS 插入失活或者删除，适合表达外源单萜类基因。Komatsu 等［46］将单萜环化酶基因与甲基转移酶基因克隆后拼接一起插入到启动子rpsJ（在S. avermitilis中具有强转录活性的启动子）下游，通过接合转移到突变株SUKA16 中表达，突变株合成三倍萜2-methylisoborneol（2-MIB，2-甲基异莰醇）。试验证明S. avermitilis 突变株可以表达不同类型的次级代谢产物，包括氨基糖苷类、非核糖体多肽类、聚酮类和萜类化合物。

3.3 Streptomyces lividans

杀稻瘟菌素（blasticidin S）是具有强抑制真菌活性的肽核苷类抗生素，由于杀稻瘟菌素产生菌S. griseochromogenes 的遗传操作难以进行，无法研究杀稻瘟菌素体内的生物合成。Li 等［39］将包含有杀稻瘟菌素基因簇（bls）嫁接到Streptomyces lividans HXY16 的染色体上表达，发酵结果，突变株S. lividans LL2 没有产生杀稻瘟菌素而产生去氨基羟化杀稻瘟菌素（Deaminohydroxymildiomycin，OHBS）。生物信息学分析发现，S. lividans 本身存在杀稻瘟菌素脱氨酶（SLBSD），基因敲除S. lividans LL2 中SLBSD 产生突变株S. lividans WJ2 能够合成完整的杀稻瘟菌素，并可对杀稻瘟菌素生物合成基因簇关键基因进行体内功能研究。与杀稻瘟菌素有相似性结构的肽核苷类抗生素米多霉素（Mildiomycin）具有强抑制植物白粉病的生物活性。在发酵液中发现Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 除产米多霉素外还产3 种衍生物［2］，在产生菌Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 中做敲除试验不利于分析米多霉素合成途径。为研究米多霉素的合成途径，Li 等［47］构建Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 基因组文库，利用杀稻瘟菌素胞嘧啶核苷单磷酸水解酶基因blsM 设计兼并引物，筛选到6 个cosmid。6 个cosmid 在Streptomyces lividans 1326 中异源表达，其中cosmid 14A6 在Streptomyces lividans 1326 中异源表达合成米多霉素，即cosmid 14A6 包含合成米多霉素所必须的完整基因簇［48］。结合异源表达及体外研究确定米多霉素基因簇边界，并研究milA、milB 及milC 的功能，推测整个米多霉素的合成途径［47，48］。信息学分析结合敲除实验确定了参与米多霉素生物合成的基因，其中milO 基因编码LuxR 家族转录因子可能是途径特异性调节因子，milK 基因编码Major Facilitator Superfamily（MFS）。MilO、milK 可能是正调节子基因，过表达这两个基因可能提高米多霉素的产量［49］。

4 小结

放线菌的次级代谢产物具有重要的药用价值，聚酮化合物的多种生物活性及合成规律性，使其具有巨大的潜在的药物开发及商业价值。现今抗药性病原菌的增加，新型细菌病毒的不断出现，提高抗生素产量和寻找新药是人们在药物开发过程中的长期目标。利用基因技术改变生物合成途径，在转录和翻译水平上调节基因簇的转录表达，核糖体相关蛋白的定点突变与随机突变相结合，构建异源表达宿主及外源基因簇的表达等方法提高目的产物产量。异源表达以及关键基因的调节等方法的研究为组合生物学奠定基础，通过组合生物学合成一些非天然次级代谢产物，利用基因技术改造聚酮化合物的基因簇以产生更多不同的活性化合物，组合生物学为新药的研发提供丰富的资源［50］。

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