罗红霉素经caveolin-1-p-ERK 1/2对离体哮喘大鼠气道平滑肌细胞cyclinD1表达的影响

陈慧君 王瑞丽 戴元荣

罗红霉素经caveolin-1-p-ERK 1/2对离体哮喘大鼠气道平滑肌细胞cyclinD1表达的影响

陈慧君 王瑞丽 戴元荣

目的 探讨罗红霉素（RXM）经caveolin-1-p-ERK1/2对离体哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）cyclinD1表达的影响。方法将30只SPF级雄性SD大鼠随机均分为对照组和哮喘组，以卵白蛋白致敏和激发复制哮喘气道重塑模型；采用Image-Pro Plus Version 6．0图像分析软件测定支气管壁和支气管平滑肌层厚度；透射电镜观察两组大鼠ASMCs微囊表达情况；CCK-8检测不同浓度RXM[A组（只含0．1%DMSO）、R10组（含RXM10μg/ml+0．1%DMSO）、R25组（含RXM 25μg/ml+0．1%DMSO）、R50组（含RXM50μg/ml+0．1%DMSO）、R100组（含RXM 100μg/ml+0．1%DMSO）]干预哮喘ASMCs后细胞的增殖情况，Western blot测定caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表达。结果哮喘组支气管壁和支气管平滑肌层明显增厚，而微囊表达匮乏。哮喘组大鼠支气管壁与平滑肌层厚度均高于对照组（均P＜0．01）。各RXM干预组ASMCs A值均低于A组，其中R100组明显低于A组（P＜0．05）。R100组caveolin-1表达明显高于A组及R10组，cyclinD1表达明显低于A组及R10组，差异均有统计学意义（P＜0．05或0．01）；R25、R50、R100组P-ERK表达均明显低于A组，差异均有统计学意义（P＜0．05或0．01）。哮喘ASMCs增殖活性与caveolin-1蛋白表达呈负相关（P＜0．05），与p-ERK及cyclinD1蛋白表达呈正相关（P＜0．05或0．01）；caveolin-1与p-ERK蛋白表达呈负相关（P＜0．01），与cyclinD1蛋白表达呈正相关（P＜0．01）；p-ERK与cyclinD1蛋白表达呈正相关（P＜0．01）。结论RXM可能通过上调caveolin-1表达、抑制ERK1/2活化，进而影响cyclinD1的表达，从而抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。

哮喘 气道平滑肌细胞 Caveolin-1 p-ERK1/2 cyclinD1 罗红霉素

气道重塑是哮喘的重要特征，其结构改变包括气道上皮损伤、上皮下纤维化、气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖、杯状细胞增生肥大以及血管生成[1]，其中ASMCs增殖在气道重塑中的作用受到广泛关注[2]。微囊是存在于细胞膜上的内陷微结构，微囊蛋白（caveolins）为其标记蛋白。研究表明，caveolins可调节多种细胞的增殖，其表达缺失与细胞过度增殖有关[3]。而caveolins中的caveolin-1在ASMCs中表达丰富。ERK1/2信号通路激活后可作用于核转录因子，与细胞的增殖和分化密切相关，笔者的前期研究证实哮喘大鼠气道平滑肌层ERK1/2活化增加[4]。细胞增殖最终需通过细胞周期完成有丝分裂过程，在整个细胞周期中，G1/S期是真核细胞有丝分裂过程中的“限制点”，决定细胞是否进入周期进行有丝分裂。近年来的研究表明，细胞周期素D1（cyclinD1）与此“限制点”密切相关。罗红霉素（roxithromycin，RXM）是一种半合成的十四元环大环内脂类抗生素，可以抑制哮喘大鼠气道重塑，但其机制并未完全阐明。本实验拟建立大鼠慢性哮喘模型，体外培养ASMCs，探讨RXM是否可经caveolin-1-p-ERK1/ 2对cyclinD1表达产生影响，从而抑制离体哮喘ASMCs的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：SPF级健康雄性SD级大鼠30只，4～6周龄，体质量100～120g。随机分为对照组及哮喘组，每组15只。主要试剂：卵白蛋白（OVA，美国Sigma公司），兔源性caveolin-1多克隆抗体（美国Abcam公司），小鼠源性P-ERK1/2单克隆抗体、兔源性总ERK1/ 2单克隆抗体、小鼠源性cyclinD1单克隆抗体（美国Cell Siganling公司），HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG（江苏碧云天生物技术研究所），RXM粉剂（法国Usiphar公司）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠气道重塑模型制备 参照Palmans等[5]的方法制备哮喘大鼠气道重塑模型。致敏阶段：第1天和第8天腹腔注射含1mg OVA和100mg氢氧化铝的混合液1ml；激发阶段：第15天开始雾化吸入氯化钠溶液8ml（0.9%氯化钠溶液与OVA混合，OVA终浓度为1%）激发哮喘，30min/次，隔日1次，共8周。对照组致敏阶段腹腔注射0.9%氯化钠溶液1ml，激发阶段以0.9%氯化钠溶液8ml雾化。

1.2.2 支气管壁与支气管平滑肌层厚度测定 采用Image-Pro Plus Version 6.0图像分析软件测量两组大鼠支气管基底膜周径（Pbm）、支气管管壁总面积（Wat）、支气管平滑肌面积（Wam）。并用Pbm将测得的Wat、Wam标准化，以Wat/Pbm、Wam/Pbm分别代表支气管壁和平滑肌层厚度。

1.2.3 ASMCs体外培养及鉴定 按照文献[6]所报道的方法培养原代及传代ASMCs。取第3代ASMCs进行平滑肌细胞鉴定。

1.2.4 ASMCs微囊表达变化观察 两组大鼠均取第3～6代ASMCs制作电镜标本，采用透射电镜观察微囊的表达情况。

1.2.5 RXM对哮喘大鼠ASMCs增殖的影响 将哮喘大鼠的ASMCs单细胞悬液按2×105/ml的密度接种于96孔板，100μl/孔，随机分为A组（只含0.1%DMSO）、R10组（含RXM10μg/ml+0.1%DMSO）、R25组（含RXM 25μg/ml+0.1%DMSO）、R50组（含RXM50μg/ml+0.1% DMSO）、R100组（含RXM 100μg/ml+0.1%DMSO），并设立空白组（只含培养基，不含细胞），每组设6个复孔。首先用不含血清的RPMI 1640饥饿24h，使细胞同步于G0期，然后用含不同浓度RXM的10%F月S RPMI1640培养基培养48h。培养结束后，每孔加入10μl的CCK-8试剂，混匀后置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养1～4h。酶联免疫检测仪450nm波长条件下测定各孔吸光度A值。取6个复孔的平均值作为该组的代表值，重复5次。依下列公式计算各组ASMCs增殖活性：细胞增殖活性（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As代表实验孔吸光度值（含培养基、CCK-8、ASMCs、不同浓度RXM）；Ac：代表对照孔吸光度值（含培养基、CCK-8、ASMCs）；Ab：代表空白孔吸光度值（含培养基、CCK-8）。

1.2.6 caveolin-1、p-ERK、cyclinD1的蛋白表达 采用Western blot测定。取第6代哮喘大鼠的ASMCs，按“1.2.5 RXM对哮喘大鼠ASMCs增殖的影响”中的分组方法干预哮喘ASMCs，提取蛋白，月CA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳、转膜，室温下5%脱脂牛奶摇床封闭1h，分别加caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗体（1∶1 000）、p-ERK小鼠抗大鼠单克隆抗体（1∶1 000）、cyclinD1小鼠抗大鼠单克隆抗体（1∶1 000），4℃过夜。次日洗膜后加5%脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶2 500）或羊抗小鼠二抗（1∶2 500），室温下摇床孵育1h，洗膜后滴加ECL发光液，根据荧光强弱选择适当的时间显影、定影。Gel pro软件分析caveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白光密度（OD）值，并与内参OD值比较作为各目的蛋白相对含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件，所得数据均以表示。正态分布资料的多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett′s T3检验；非正态分布资料的多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi法检验；两变量的相关分析用Pearson直线相关法。

2 结果

2.1 两组大鼠肺组织病理学改变情况 对照组大鼠结构完整，支气管及血管周围未见明显炎细胞浸润，支气管平滑肌层未见明显增厚（图1）。哮喘组大鼠支气管平滑肌层明显增厚，管腔狭窄，周围大量炎症细胞浸润（图2）。

图1 对照组大鼠肺组织病理改变（HE染色，×200）

图2 哮喘组大鼠肺组织病理改变（HE染色，×200）

2.2 两组大鼠支气管壁和平滑肌厚度比较 对照组大鼠支气管壁与平滑肌层厚度分别为（46.83±21.09）、（23.16± 2.79）μm，哮喘组大鼠分别为（105.72±24.31）、（45.93±14.59）μm，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.3 ASMCs体外培养及鉴定结果 体外培养的ASMCs于倒置显微镜下观察呈束状或螺旋状，可观察到典型的“峰-谷”状（平滑肌细胞生长的重要特征，图3）。平滑肌细胞内特异的α-actin免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜下观察，可见平滑肌细胞内的肌丝结构，沿细胞的纵轴分布（平滑肌细胞特有的结构，图4）。

2.4 两组大鼠ASMCs微囊透射电镜观察情况 正常组大鼠ASMCs微囊含量丰富，结构完整，形态及大小多变（图5）；哮喘组大鼠ASMCs微囊表达明显匮乏，结构破坏严重（图6）。

图3 倒置显微镜下体外培养ASMCs（×100）

图4 激光共聚焦显微镜下ASMCs内部红色丝状物（×400）

图5 透射电镜下正常组ASMCs微囊（×6 000）

图6 透射电镜下哮喘组ASMCs微囊（×6 000）

2.5 不同浓度RXM对哮喘大鼠ASMCs增殖的影响 细胞增殖越多越快，颜色越深，所测吸光度A值越大。A组、R10组、R25组、R50组及R100组ASMCs A值分别为 0.64±0.13、0.54±0.13、0.52±0.12、0.45±0.13、0.38± 0.12，增殖活性分别为100%、87.6%、84.2%、73.4%、60.4%，各RXM干预组ASMCs A值均低于A组，其中R100组明显低于A组（P＜0.05）。

2.6 各组哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表达 见表1及图7-9。

表1 各组哮喘大鼠ASMC scaveolin-1、p-ERK、cyclinD1蛋白的表达

由表1可见，R100组caveolin-1表达明显高于A组及R10组，cyclinD1表达明显低于A组及R10组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）；R25、R50、R100组P-ERK表达均明显低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.7 相关关系 哮喘ASMCs增殖活性与caveolin-1蛋白表达呈负相关（r=-0.881，P＜0.05），与p-ERK及cy-clinD1蛋白表达呈正相关（r=0.933、0.988，P＜0.05或0.01）；caveolin-1与p-ERK蛋白表达呈负相关（r=-0.811，P＜0.01），与cyclinD1蛋白表达呈负相关（r=-0.696，P＜0.01）；p-ERK与cyclinD1蛋白表达呈正相关（r=0.921，P＜0.01）。

图7 caveolin-1的表达

图8 P-ERK的表达

图9 cyclinD1的表达

3 讨论

RXM是一种半合成的十四元环大环内脂类抗生素，不但有抗菌活性，而且还有免疫调节、抗炎和抗氧化活性[7]。戴元荣等[8]的研究发现，RXM与吸入性糖皮质激素联合应用，可提高哮喘的治疗疗效。吴立琴等[9]的研究发现，RXM可通过PI3K途径抑制哮喘大鼠ASMCs增殖。本研究结果显示，随着RXM干预浓度增高，细胞增殖活性逐渐下降，表明RXM抑制哮喘ASMCs增殖的作用具有浓度依赖性，当RXM浓度达到100μg/ml时，细胞增殖所受抑制明显高于A组。

Caveolae是一种内陷微结构，研究发现其与细胞增殖相关的受体和信号蛋白在该结构中明显富集[10]，提示caveolae可能参与细胞增殖过程。Caveolin-1是一种分子量为22kDa的跨膜蛋白，其N端含有一个由20个氨基酸组成的铰手架区域，可以连接并调控多种受体和信号蛋白[11]。Gosens等[12]的研究发现，在丝裂原缺乏的条件下，siRNA敲除caveolin-1仍可导致ASMCs增殖，而且还发现在处于增殖状态的平滑肌细胞caveolin-1的含量只有静止状态下的一半，提示caveolin-1可能负性调控ASMCs的增殖。本研究结果显示，正常组大鼠ASMCs caveolae表达丰富，大小及体积多变，而哮喘组大鼠ASMCs caveolae表达明显匮乏而平滑肌层明显增厚，提示哮喘组大鼠caveolae/caveolin-1缺乏与ASMCs过度增殖有关；此外还发现，RXM干预哮喘组大鼠ASMCs后，caveolin-1表达增加，且与细胞增殖活性呈负性相关，提示RXM可通过增加caveolin-1的表达而发挥其抑制ASMCs增殖的作用。

ERK1/2可将信号由细胞表面受体转移至细胞核，激活细胞的转录因子，与细胞增殖和分化紧密相关。笔者的前期实验研究发现，哮喘大鼠气道平滑肌层ERK1/ 2的活化增加。另有研究发现，采用β-环糊精或siRNA敲除caveolin-1可导致ERK1/2活化。本研究发现，caveolin-1表达与哮喘ASMCs增殖活性呈负相关，ERK1/2的活化与哮喘ASMCs增殖活性呈正相关，caveolin-1与p-ERK1/2的表达存在负相关，而且RXM干预哮喘ASMCs后caveolin-1表达增加、ERK1/2活化减少，提示RXM可通过上调caveolin-1表达、抑制ERK1/2活化而抑制ASMCs的增殖。

G1/S是真核细胞有丝分裂过程中的“限制点”。研究表明，cyclinD1与哮喘ASMCs增殖密切相关[13]。张爱芝等[14]的研究还发现，ERK信号通路可能通过对cyclinD1表达的调控而影响哮喘ASMCs增殖。本研究发现，哮喘ASMCs增殖活性及p-ERK蛋白表达均与cyclinD1表达呈正相关，caveolin-1蛋白表达与cyclinD1表达呈负相关，而且RXM干预哮喘ASMCs后，随着caveolin-1上调、ERK1/2活化被抑制，cyclinD1表达逐渐下降，提示RXM可能通过caveolin-1-p-ERK1/2抑制了cyclinD1的表达，使细胞周期阻滞于G1/S期，从而抑制哮喘ASMCs增殖，但其确切机制仍有待进一步研究。

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Effect of roxithromycin on cyclin D1 expression in airway smooth muscle cells of asthmatic rats and its mechanism

Objective To investigate the effect of roxithromycin(RXM)on cyclinD1 expression in cultured airway smooth muscle cells（ASMCs）of asthmatic rats and its mechanism．MethodsThirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and asthmatic group．The chronic asthma was induced by the sensitization and provocation of ovalbumin in rats．The total bronchial wall thickness(Wat/Pbm)and the bronchial smooth muscle thickness(Wam/Pbm)were measured with image-pro plus 6．0；the changes of caveolae in AMSCs were observed by transmission electron microscope．The proliferation of cultured ASMCs induced by different concentrations of roxithromycin(group A:0．1%DMSO,group R10:RXM10μg/mL+0．1%DMSO,groupR25:RXM 25μg/ml+0．1%DMSO,group R50:RXM50μg/ml+0．1%DMSO,group R100:RXM 100μg/ml+0．1%DMSO)was tested by CCK-8．The protein expressions of caveolin-1,P-ERK,cyclinD1 of ASMCs were measured by Western blot．ResultsThe Wat/Pbm,Wam/Pbm of asthmatic group were significantly higher than those of control group(P＜0．01)．There were a few of caveolae in ASMCs of asthmatic rats．A value in all intervention groups was lower than that in group A,particularly in group R100 (P＜0．05)．The expression of caveolin-1 in group R100 was significantly higher and the expression of cyclinD1 was significantly lower than those in group A and group R10(P＜0．05 or P＜0．01);the expression of P-ERK in group R25,R50,R100 were significantly lower than those in group A(P＜0．05 or P＜0．01)．There were significantly negative correlation of cell activity rate of asthmatic rats with the expressions of caveolin-1 protein(P＜0．05)and positive correlation with the expressions of P-ERK or cyclinD1 protein(P＜0．05 or P＜0．01)．The expression of caveolin-1 protein was negatively correlated with P-ERK and cyclinD1(P＜0．01), and the expression of P-ERK protein was positively correlated with cyclinD1(P＜0．01)．ConclusionRoxithromycin inhibits cy-clinD1 expression and cell proliferation in ASMCs from asthmatic rats,which is associated with up-regulation of caveolin-1 expressions and down-regulation of p-ERK expressions．

Asthma Airway smooth muscle cells Caveolin-1 p-ERK Roxithromycin

2013-05-31）

（本文编辑：欧阳卿）

浙江省卫生厅科研基金资助项目（2009A144）

321000 金华市中心医院呼吸内科（陈慧君）；温州医科大学附属第二医院呼吸内科（王瑞丽、戴元荣）

戴元荣，E-mail：daiyr@126.com