高碳酸培养环境对A549细胞合成、分泌肺泡表面活性蛋白C的影响

黎阳，彭丹晖，老启芳，黄英明，覃韬，谢显龙，黄冰

（广西医科大学附属肿瘤医院重症医学科，广西南宁 530021）

高碳酸培养环境对A549细胞合成、分泌肺泡表面活性蛋白C的影响

黎阳，彭丹晖，老启芳，黄英明，覃韬，谢显龙，黄冰

（广西医科大学附属肿瘤医院重症医学科，广西南宁 530021）

目的研究不同培养浓度CO2对A549活性、合成和分泌肺泡表面活性蛋白C(SP-C)的影响，为允许性高碳酸血症的肺保护机制提供理论依据。方法A549细胞按不同CO2培养浓度分为A组(5%CO2)、B组(10%CO2)和C组(18%CO2)。细胞培养24 h、36 h、48 h后，采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性；免疫印迹法检测细胞内肺泡表面活性蛋白C前体蛋白(proSP-C)的水平；酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清液中SP-C的浓度。结果(1)与A组比较，B组各观测点的细胞活性均增高；C组的细胞活性则在36 h、48 h降低。(2)B组36 h、48 h细胞培养液中SP-C浓度较A组升高，但是细胞内proSP-C差异无统计学意义。(3)与A组比较，C组24 h培养液中的SP-C浓度已开始降低，但胞内proSP-C在36 h才开始下降。结论(1)一定的CO2培养浓度升高不影响A549的活性，对SP-C的合成和分泌起促进作用；(2)过高的CO2培养浓度可抑制A549的活性、SP-C的合成和分泌。

高碳酸血症；A549细胞；肺泡表面活性蛋白C；肺泡表面活性蛋白C前体蛋白

在呼吸机通气过程中，为避免/减轻患者的呼吸机相关性肺损伤(Ventilator associated lung injury，VALI)，往往采用小潮气量的肺保护通气策略。这种以肺保护为目的，降低潮气量而导致的PaCO2升高被称为允许性高碳酸血症(Permissive hypercapnia，PHC)。PHC刚开始时被认为是小潮气量通气的结果，近年来研究发现PHC本身就具有肺保护的作用。在VALI的病理过程中，肺泡Ⅱ型细胞(ATⅡ)对维持肺功能、修复肺泡上皮损伤起着重要的作用；肺泡表面活性蛋白C(Surfactant protein C，SP-C)是一种由ATⅡ分泌至肺泡腔内的特异性蛋白，具有降低肺泡表面张力，维持肺泡形态稳定的功能[1]；通过对ATⅡ细胞内SP-C前体蛋白proSP-C检测，可评估ATⅡ的活性及表达SP-C的能力[2]。A549是来源于肺腺癌的细胞系，是常用的ATⅡ细胞模型[3]。为了探讨PHC自身的肺保护机理，本研究在2012年4月至2013年4月期间，选用不同的CO2浓度培养A549，通过噻唑蓝比色法(MTT)了解高碳酸环境对A549生物活性的影响；Western blot检测细胞内proSP-C浓度、ELISA检测培养液中SP-C的量，了解CO2对A549功能活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器(1)细胞株：A549细胞。(2)实验试剂：1640细胞培养液(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；二甲基亚砜(Sigma)、噻唑蓝(Sigma)；SP-C的ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；RIPA裂解液(中国碧云天生物技术研究所)；SP-C兔抗人多克隆抗体(eBioscience)；β-actin内参抗体(Abcam)；HRP标记的山羊抗兔二抗(Santa)。(3)实验仪器：BDInflux流式细胞仪(碧迪医疗器械上海有限公司)；CO2细胞培养箱(美国Alpha Innotech)；丹麦雷度800血气仪；酶标分析仪(上海翔升生物科技有限公司)。

1.2 细胞传代培养A549细胞悬液加入RPMI-1640培养基，置于37℃，5%CO2浓度，湿饱和的细胞培养箱培育；传代后液氮冻存。

1.3 实验模型的建立及分组冻存A549细胞复苏后培养，细胞周期同步化；把对数生长期的细胞悬液接种96孔培养板，每孔200 μl，细胞数约为4 000个。待细胞贴壁生长后随机置入3个不同CO2浓度的细胞培养箱中培养，在24 h、36 h、48 h培养后进行检测，分组及分组条件如下：A组，设置细胞培养箱中CO2浓度为5.0%，37℃，水饱和；B组，设置细胞培养箱中CO2浓度为10.0%，37℃，水饱和；C组，调整细胞培养箱中CO2浓度为18.0%，37℃，水饱和。

1.4 检测方法(1)噻唑蓝(MTT)比色法测细胞活性,每个时点设15个复孔。每个孔在观测点加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，并继续孵育4 h；弃去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min后酶标仪检测各孔对490 nm波长的吸光度(OD)。(2)细胞培养孔上清液的血气分析，每个时点6个复孔。2 ml注射器采集观测时点细胞培养孔的上清液；血气分析仪对上清液进行血气分析。(3)Western blot检测细胞中proSP-C蛋白的表达，每个时点6个复孔。RIPA裂解液提取每个培养孔的细胞总蛋白；BCA法测提取细胞总蛋白的浓度；聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，β-actin作为内参抗体；转膜、洗膜、封闭，proSP-C多抗孵育、荧光二抗孵育后显影；proSP-C蛋白条带灰度和内参灰度的比值计算蛋白相对量。(4)ELISA检测细胞培养上清中SP-C，每个时点6个复孔。采集观测时点细胞培养孔的上清液；按试剂盒操作说明检测上清液中SP-C浓度。

1.5 统计学方法采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±S)表示，组间比较采用方差分析(SNK法)，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度CO2条件下培养A549细胞MTT结果比较B组与A组比较，24 h(q=5.72，P＜0.01)、36 h(q=3.45，P＜0.05)OD值均增高；C组与A组比较，24 h(q=8.58，P＜0.01)、36 h(q=8.05，P＜0.01)、48 h(q= 7.59，P＜0.01)的OD值均降低，见表1。

2.2 不同浓度CO2条件下培养液血气分析结果B、C两组pH值均小于A组相同时点(P＜0.01)，B、C两组间比较，C组的pH值较B组更低(P＜0.01)。B、C两组的PCO2高于A组相同时点(P＜0.01)，B、C两组间比较，C组的PCO2较B组更高(P＜0.01)。B、C两组的HCO3-高于A组相同时点(P＜0.01)，B、C两组间比较，36 h、48 h时C组的PCO2较B组更高(P＜0.01)，见表2。

表2 培养液血气分析比较结果（n=6±s）

表2 培养液血气分析比较结果（n=6±s）

注：与A组比较，aP＜0. 01；与B组比较，bP＜0.01。1 mmHg=0.133 kPa。

组别项目pH A B C F值P值PCO2(mmHg) A B C F值P值HCO3-(mmol/L) A B C F值P值24 h 7.25±0.03 7.10±0.04a6.93±0.03ab135.48 0.00 33.7±2.3 52.8±4.1a79.0±6.3ab150.67 0.00 14.20±0.09 15.57±0.31a15.55±0.12a93.63 0.00 36 h 7.21±0.02 7.06±0.02a6.92±0.02ab316.61 0.00 33.7±2.3 52.8±1.9a79.5±3.8ab408.14 0.00 12.13±0.14 14.23±0.14a15.50±0.20ab658.33 0.00 48 h 7.14±0.01 7.05±0.05a6.93±0.04ab47.43 0.00 32.2±1.5 53.0±5.4a75.7±8.2ab86.37 0.00 10.52±0.32 13.73±0.15a15.10±0.18ab632.27 0.00

注：与A组比较，aP＜0. 05；bP＜0.01。

2.3 A549 细胞内proSP-C表达水平的比较免疫印迹法检测proSP-C的结果如图1所示。B组与A组比较，A549细胞内SP-C水平在各时点差异无统计学意义(P＞0.05)；C组与A组比较，A549细胞内proSP-C在36 h(q=5.88，P＜0.01)，48 h(q=6.16，P＜0.01)表达降低，见表3。

图1 A549细胞内proSP-C的表达

表3 A549细胞内proSP-C表达水平的比较(OD值，±s)

表3 A549细胞内proSP-C表达水平的比较(OD值，±s)

注：与A组比较，aP＜0. 05；bP＜0.01。

组别A组B组C组F值P值24 h 0.58±0.15 0.63±0.20 0.49±0.08 1.31 0.30 36 h 0.63±0.09 0.65±0.18 0.31±0.14b10.90 0.00 48 h 0.55±0.11 0.49±0.19 0.23±0.02a10.71 0.00

2.4 A549细胞培养上清液中SP-C浓度的比较B组与A组比较，SP-C在36 h(q=18.43，P＜0.01)，48 h (q=43.28，P＜0.01)浓度增加；C组与A组比较，SP-C在24 h(q=4.51，P＜0.05)、36 h(q=23.96，P＜0.01)、48 h (q=59.51，P＜0.01)浓度降低，见表4。

表4 A549细胞培养上清中SP-C浓度比较(ng/ml，±S)

表4 A549细胞培养上清中SP-C浓度比较(ng/ml，±S)

注：与A组比较，aP＜0. 05；bP＜0.01。

组别A组B组C组F值P值24 h 20±1.2 21±2.2 18±1.3a5.27 0.02 36 h 21±0.9 31±2.0b18±0.7b157.36 0.00 48 h 26±1.0 42±1.1b20±0.5a946.28 0.000

3 讨论

细胞开放培养的CO2浓度一般为5%，过高的CO2浓度可影响培养细胞的活性，甚至导致细胞凋亡或死亡。随着细胞培养箱内CO2浓度升高，溶解在细胞培养液中CO2必然增加，导致培养液的PCO2跟随着升高；细胞培养液是细胞接触的外环境，其理化性质的改变直接影响细胞的生物活性。溶解在细胞培养液中的CO2和HCO3-形成缓冲对，维持培养液pH值的稳定，从而保证了细胞的正常生长。B、C两组培养液pH值较A组都明显下降，且CO2培养浓度越高下降越明显。虽然培养液中HCO3-可一定程度上缓冲pH的升高，但随着CO2溶解量的增加，培养液的pH值逐渐出现了下降。

MTT实验是一种检测细胞存活和生长的方法，可间接反映培养皿中存活细胞的数量。B组的MTT实验结果提示：随着CO2培养浓度的升高，一定程度的pH值降低或PCO2升高可刺激A549细胞活性的升高。有研究提示：在对A549细胞损伤模型的研究中，CO2培养浓度一定程度的升高可减少细胞凋亡蛋白酶活化和降低细胞凋亡率[4]。动物实验亦报道：允许性高碳酸血症可减少大鼠移植肺ATⅡ的细胞器损坏和凋亡率，改善大鼠移植肺的肺功能[5]；对大鼠移植肺的保护机理可能是调节氧化和抗氧化的平衡，减少炎症介质、氧自由基对ATⅡ的攻击。在本研究中，B组细胞活性升高可能和凋亡受抑制，细胞器受损减轻有关。C组的MTT实验结果提示：培养环境pH值过低或PCO2过高可降低A549的细胞活性，这样的结果可能和高碳酸环境对细胞的毒性有关。有研究证实：代谢性酸中毒可抑制细胞内呼吸，降低细胞的代谢水平，抑制细胞内能量代谢[6]；Vohwinkel等[7]报道：过高的PCO2可对线粒体功能产生损害，ATP生成减少抑制细胞的能量代谢，最终导致细胞增殖受抑。

与A组相比较，B组培养上清液中SP-C浓度在36 h、48 h明显增高，提示了培养液中一定的pH下降和PCO2升高可以刺激SP-C的分泌。然而B组较A组A549细胞中proSP-C表达水平未表现出升高，与培养液中SP-C浓度变化不吻合，考虑可能与proSP-C转化加快有关。由于proSP-C转化SP-C并分泌加快，因此B组的proSP-C并未检测出升高。有关pH值下降促使proSP-C转化的推断还需进一步研究证实。C组各时点培养液中SP-C的浓度较A组都要降低。虽然C组A549细胞中proSP-C表达水平在24 h较A组无变化，但36 h、48 h的proSP-C表达水平出现了明显的下降。上述实验结果提示：过高的PCO2环境可降低A549活性，影响其细胞内部特异性蛋白SP-C的合成与分泌。有研究表明：ATⅡ除了能够增殖进行自我更新，并可以通过分裂脱去颗粒而转分化为其他细胞[8]；高浓度CO2是否可导致A549细胞向其他细胞的转分化，导致了SP-C表达、合成、分泌的减少还有待证实。

综上所述，允许性高碳酸血症本身就具有肺保护的作用，并非仅仅是肺保护性通气策略的结果。然而，高碳酸血症超出了一定范围，不但不具有肺保护的功能，而且还会抑制ATⅡ增殖，影响肺上皮修功能及其完整性，可能导致或加重急性肺损伤(ALI)。

参考资料：

[1]Pohlmann G,Iwatschenko P,Koch W,et al.A novel continuous powder aerosolizer(CPA)for inhalative administration of highly concentrated recombinant surfactant protein-C(rSP-C)surfactant to preterm neonates[J].J Aerosol Med Pulm Drug Deliv,2013,26 (6):370-379.

[2]Glasser SW,Senft AP,Maxfield MD,et al.B Genetic replacement of surfactant protein-C reduces respiratory syncytial virus induced lung injury[J].Respir Res,2013,14(1):19.

[3]Wondwossen A,Abdulaziz A,Alghaithy B,et al.Surfactant lipids regulate LPS-induced interleukin-8 production in A549 lung epithelial cells by inhibiting translocation of TLR4 into lipid raft domains [J].J Lipid Res,2010,51(2):334-344.

[4]Ando T,Mikawa K,Nishina K,et al.Hypocapnic alkalosis enhances oxidant-induced apoptosis of human alveolar epithelial type II cells[J].J Int Med Res,2007,35(1):118-126.

[5]申东方,王玲,谭晶,等.治疗性高碳酸血症对大鼠移植肺肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响[J].中华麻醉学,2011,31(4):4795-4797.

[6]Jay B.Hypercapnia causes cellular oxidation and nitrosation in addition to acidosis:implications for CO2chemoreceptor function and dysfunction[J].JAppl Physiol,2010,108(6):1786-1795.

[7]Vohwinkel CU,Lecuona E,Sun H,et al.Elevated CO2levels cause mitochondrial dysfunction and impair cell proliferation[J].J Biol Chem,2011,286(43):37067-37076.

[8]Bishop AE.Pulmonary epithelial stem cells[J].Cell Prolif,2004,37 (1):89-96.

Effect of different concentrations of carbon dioxide on the synthesis and secretion of surfactant protein C in A549 cells.

LI Yang,PENG Dan-hui,LAO Qi-fang,HUANG Ying-ming,QIN Tao,XIE Xian-long,HUANG Bing. Intensive Care Unit,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of carbon dioxide on the synthesis and secretion of surfactant protein C(SP-C)in A549 cells.MethodsA549 cells were divided into group A(5% CO2),group B(10%CO2)and group C(18%CO2)according to different concentrations of carbon dioxide.After culturing for 24,36 and 48 hours,the survival state of those cells was estimated by MTT assay,the precursor protein of surfactant protein-C(proSP-C)was measured by western blot,and the concentration of SP-C in the cell culturesupernatants was measured by ELISA method.Results(1)Compared with group A,group B showed higher activity at 24 h, 36 h,and 48 h,while group C had a lower activity at 36 h and 48 h(MTT assay).(2)SP-C concentration in the culture supernatants of group B was higher than that of group A,however,there was no statistical difference in the expression of proSP-C.(3)Compared with group A,an increasing of SP-C concentration in 24 h culture supernatants and a decreasing of proSP-C concentration in 36 h culture supernatants in group C were observed.Conclusion(1)10%CO2dose not affect the proliferation of A549 cells,but can promote the synthesis and secretion of SP-C in A549 cells;(2) 18%CO2can inhibite the synthesis and secretion of SP-C as well as limit the proliferation inA549 cells.

Hypercapnia;A549;SP-C;proSP-C

R329.2+5

A

1003—6350（2014）20—2970—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1169

2014-04-06)

广西医疗卫生重点科研课题（编号：重2010078）

黄冰。E-mail：hhhbing@163.com