虎杖饮片、水煎剂、配方颗粒高效液相色谱特征图谱相关性研究

(培力＜南宁＞药业有限公司，广西 南宁 530007)

虎杖为蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根及根茎，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效[1]，主要含有白藜芦醇、虎杖苷、大黄素、大黄素甲醚和虎杖素A等成分[2-4]。虎杖配方颗粒是以符合炮制规范的虎杖饮片为原料，经现代化提取、浓缩、干燥、制粒等工艺技术加工而成，仅供中医师临床处方时使用的颗粒制剂，具有体积小、服用与携带方便、起效迅速、疗效确切的优点，且保留了传统中药汤剂的“原汁原味”。但中药饮片经过一系列制剂工艺加工处理制成配方颗粒后，失去了原饮片的许多外观、显微及理化特征，无法再用常规的技术手段(如显微观察、理化反应)进行有效地鉴别。若仅按照《中国药典》对其指标成分进行含量测定，则较难全面地判定配方颗粒的真伪与优劣，从而给企业或国家药品主管部门的质量控制、监管造成一定的困难。因此，制订具有专属性强、重复性好、有效可行的技术方法来控制中药配方颗粒质量，显得尤为重要[5]。特征图谱的研究比指纹图谱较简单，但能很好地给中药产品的定性鉴别提供准确的依据，其在中药配方颗粒质量标准研究方面的应用得到了国家药典委员会的认可和推崇。采用高效液相色谱(HPLC)法对虎杖饮片、水煎剂和配方颗粒的特征图谱进行相关性研究，目前尚未见报道。本研究中，采用HPLC法分别建立虎杖饮片、水煎剂和配方颗粒的特征图谱，并比较三者主要化学成分的差异，旨在为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性研究以及临床应用研究提供科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

美国Agilent 1100型高效液相色谱仪，主要包括QuatPump四元泵、VWD紫外检测器、ChemStation工作站；MILLI-Q型超纯水仪(美国)；GR-202型电子分析天平(日本)；CREST超声波处理器(美国)。虎杖对照药材(批号为120980-201005)，大黄素对照品(批号为 110756-200110)，大黄素甲醚对照品(批号为110758-200610)，均购自中国食品药品检定研究院；虎杖苷对照品(批号为MUST-11052301)，白藜芦醇对照品(批号为MUST-11050301)，购自成都曼思特生物科技有限公司；10批不同来源虎杖饮片(产地广西，编号为1-10)，均经广西区食品药品检验所韦家福老师鉴定为蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根及根茎；10批虎杖水煎剂(编号为L-U)，严格按照《医疗机构中药煎药室管理规范》药材煎煮方法相关要求制备；11批大生产虎杖配方颗粒(编号为A-K，批号A为A070299，B为A070553，C为A080064，D为A080756，E 为A081228，F为A081716，G 为 A082114，H 为 A090569，I为 A091028，J 为 A100749，K 为A101617，由培力(南宁)药业有限公司提供)；乙腈为色谱纯(Meck公司)，其他试剂均为分析纯。相似度评估软件为国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取11批虎杖配方颗粒，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，取出，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖配方颗粒供试品溶液；取10批虎杖药材粉末(过3号筛)，各取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，照制备方法制备得虎杖药材供试品溶液；称取10批虎杖饮片各100 g，加水(水面高出药材约5 cm)，浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，倒出煎液，药渣再分别加水煎煮2次，时间依次为30 min和20 min，合并3次煎液，水浴上浓缩、过滤，浓缩至浸膏，真空干燥，得干浸膏，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，照虎杖配方颗粒供试品溶液的制备方法制备得虎杖水煎剂供试品溶液。取虎杖苷对照品、白藜芦醇对照品和大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含虎杖苷40 μg、白藜芦醇20 μg和大黄素80 μg的混合溶液，即得对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱:Lichrospher RP-18e柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Merck公司)；流动相:以乙腈(A)和0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(见表 1)；检测波长:306 nm；进样量:10 μL；流速:1.0 mL/min[5]。

表1 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

选择峰2作为参照峰，计算样品中7个主要特征峰的相对保留时间(RRT)、相对峰面积(RPA)的 RSD值。以批号为A101617的虎杖配方颗粒进行方法学考察。

精密度试验:按照2.1项下方法制备虎杖配方颗粒供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果各主要特征峰RRT的 RSD为0.25% ～0.28%，RPA的 RSD为0.12% ～0.91%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:按照2.1项下方法制备虎杖配方颗粒供试品溶液，分别于制备后0，4，8，12，16，24h时检测，考察供试品溶液的稳定性。结果各主要特征峰RRT的 RSD为0.30%～0.44%，RPA的 RSD为0.07%～1.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:按照2.1项下方法制备6份虎杖配方颗粒样品溶液，依法测定，考察方法的重复性。结果各主要特征峰RRT的RSD为0.34% ～0.47%，RPA的 RSD为0.22% ～0.95%，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密称取已知含量的虎杖供试品6份，分别精密加入一定量的大黄素对照品或虎杖苷对照品，混匀后依法测定其峰面积，计算回收率。结果见表2。

2.4 虎杖配方颗粒特征图谱的建立

虎杖药材、水煎剂与配方颗粒相关性研究:分别精密吸取各供试品溶液、对照品溶液各10 μL，照拟订的色谱条件测定，记录80 min的色谱图。参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》建立HPLC特征图谱，色谱图见图1至图4。由图4可见，虎杖配方颗粒(C)与虎杖水煎剂(B)成分基本一致，而药材制成水煎剂及颗粒后，4号峰含量增加，8号峰、10号峰消失，但7个主要成分[1号、2号(虎杖苷)、3号(6号白藜芦醇)、7 号、9 号、11号(大黄素)]在虎杖饮片、虎杖水煎剂、虎杖配方颗粒中均存在。可见，虎杖饮片制成配方颗粒后，有效成分虎杖苷、大黄素、白藜芦醇尚存，故含量测定指标性成分的选择仍可参照药典。

表2 含量测定加样回收试验结果(n=6)

图1 10批虎杖药材HPLC特征图谱

图2 10批虎杖水煎剂HPLC特征图谱

图3 11批虎杖配方颗粒HPLC特征图谱

图4 虎杖饮片、水煎剂、配方颗粒HPLC特征图谱比较

参照峰的选择与共有特征峰的标定:设定各色谱图的积分参数为:斜率灵敏度为5，峰宽为0.05，最小峰峰面积占总峰面积的比例大于1%，积分起止时间10～80 min。通过比对虎杖药材、虎杖水煎剂、虎杖配方颗粒的特征图谱，选定三者均有的7个特征峰作为共有峰。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)》自动匹配虎杖配方颗粒HPLC图谱的相关参数，标定其中匹配数目为7的色谱峰为共有特征峰，共有特征峰面积均大于色谱峰总面积的90%。通过与对照品色谱图比较可知，在特征图谱的7个共有峰中，峰2为虎杖苷，峰4为白藜芦醇，峰7为大黄素。结果见图5及表3。

相似度评价:采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)》计算相似度，即以生成的对照谱图为参照，各样品特征图谱与对照谱图进行比较，计算得各批次虎杖配方颗粒图谱的相似度及各特征峰的RRT及RPA。结果见表4和表5。可见，10批虎杖药材特征图谱的相似度均在0.98以上，说明10批不同来源的虎杖药材成分有良好的相似性；11批虎杖配方颗粒特征图谱的相似度均在0.99以上，说明虎杖配方颗粒的化学成分一致性较好，该公司产品制剂工艺较稳定。所标定的虎杖配方颗粒7个共有特征峰，经多批次产品验证，各峰均可在药材及水煎剂特征图谱中得到追踪，表明了虎杖配方颗粒与虎杖药材、虎杖水煎剂在化学成分上的一致性，为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性研究以及临床应用研究提供了科学依据。另外，各峰重复性好、RRT稳定，可作为该产品特征图谱的共有峰，用于生产过程各环节的质量控制。

3 讨论

考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.1%磷酸3种流动相梯度洗脱的效果，结果以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱，峰形及分离度均较好。分别考察了同一供试品溶液于 230，254，284，306，437 nm 检测波长下的色谱图，结果 230 nm时的色谱图基线漂移较严重，437 nm时的色谱图色谱峰数量较少；254，284，306 nm检测波长下的色谱图相互比较，结果以306 nm作为检测波长的色谱图色谱峰数量较多，响应值较高，峰形和分离度较好。最终选择以乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱，以306 nm作为检测波长。

分别用甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇对虎杖配方颗粒进行超声提取，结果50%乙醇提取效率较高，色谱峰数量较多，色谱峰的强度较大，且50%乙醇对虎杖中的虎杖苷和白藜芦醇的提取效率也较高。

图5 混合对照品溶液和虎杖配方颗粒供试品溶液镜像色谱图

表3 对照特征图谱的特征数据

表4 虎杖饮片、虎杖水煎剂、虎杖配方颗粒特征图谱的相似度数据

在HPLC特征图谱中，11批配方颗粒图谱的相似度均在0.99以上，说明产品成分一致性较好，其原药材质量稳定、生产工艺稳定可靠。文中所建立的HPLC特征图谱分析方法简便、稳定、重现性好，能较全面地反映虎杖配方颗粒的内在质量，为其质量控制提供了科学依据。

表5 11批虎杖配方颗粒的RRT及RPA

目前，应用于中药配方颗粒鉴别的技术方法报道较少，仅有薄层色谱(TLC)、傅里叶-红外光谱(FT-IR)及HPLC指纹图谱等几种。前两者具有操作简单、快速等优点，但专属性不强，较难全面反映从原药材加工到中药配方颗粒整个生产过程中化学成分方面的细微差异。而HPLC特征图谱技术方法较成熟，弥补了前两者的不足，可从化学成分角度去体现中药材(或饮片)、中药汤剂与中药配方颗粒的相似(或差异)性[6]，操作也不复杂。更重要的是，它给多年来一直困扰大家的“中药饮片与中药配方颗粒是否等质”等争议性问题提供了有力的证据，也逐渐得到了国家药监部门的认可和推崇。

综上所述，本研究中所建立的虎杖配方颗粒HPLC特征图谱分析方法简便稳定、重复性好，能较全面地反映虎杖配方颗粒的内在质量，为其质量控制提供了科学依据。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:194-195.

[2]杨建文，杨彬彬，张 艾，等.中药虎杖的研究与应用开发[J].西北农业学报，2004，13(4):156-159.

[3]金雪梅，金光株.虎杖的化学成分研究[J].中草药，2007，38(10):1 446-1 448.

[4]肖 凯，宣利江，徐亚明，等.虎杖的水溶性成分研究[J].中草药，2003，34(6):496-498.

[5]杨晓日，孙 巍.中药配方颗粒探讨[J].中国药业，2007，16(14):60.

[6]徐以亮.麸炒枳壳配方颗粒特征图谱研究[J].中国药业，2012，21(22):46-47.