高效液相色谱法测定藏成药二十五味儿茶丸中乌头碱的含量

达娃卓玛，武尉杰，魏 屹，谭 睿

(1.西藏自治区食品药品检验所，西藏 拉萨 850000； 西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

二十五味儿茶丸是藏医传统药方，用于治疗“白脉”病、痛风、风湿性关节炎、关节肿痛变形与四肢僵硬、黄水病、“冈巴”病等。本品由儿茶、西藏棱子芹、黄精、天冬、喜马拉雅紫茉莉、蒺藜、乳香、决明子、黄癸子、宽筋藤、麝香、铁棒锤等25味中藏药组方，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药(第1册)》，未涉及方中成分的定性和定量测定方法。铁棒锤中二萜类生物碱既是有效成分，也是毒性成分。为了更好地控制二十五味儿茶丸的质量，以高效液相色谱(HPLC)法对方中铁棒锤所含乌头碱进行含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LC-6AD型高效液相色谱仪；Class VP色谱工作站。乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110720-201111)；二十五味儿茶丸(西藏自治区藏药厂，批号分别为12023A，11240A；西藏神猴药业有限公司，批号为20120402；青海省藏医院制剂；青海金诃藏药药业股份有限公司，批号分别为20090902，20101018，20110926，20110718；四川省甘孜藏族自治州藏医院，批号为201103001)；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1-4]

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相:0.04 mol/L三乙胺(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(60∶40)；检测波长:233 nm；柱温:40℃。理论板数按乌头碱计应不低于3000。

2.2 溶液制备

取乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05%盐酸甲醇制成每1 mL含14.96 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品适量，研细，取5 g，置锥形瓶中，加氨试液4 mL及乙醚50 mL，摇匀，超声处理(功率120 W，频率40 kHz)30 min，滤过，残渣同法再提取1次，滤过，合并滤液，低温挥干，残渣用0.05%盐酸甲醇溶液溶解，转移至5 mL容量瓶中，加0.05%盐酸甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察[5-6]

专属性试验:按照处方比例，取除去铁棒锤的方中其他药材，制备阴性样品。取适量阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取阴性对照品溶液、供试品溶液、对照品溶液依法进样测定。结果二十五味儿茶丸中其他成分对乌头碱的测定无干扰，专属性良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:称取乌头碱对照品7.48mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加0.05%盐酸甲醇溶解至刻度。精密吸取上述对照品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.05%盐酸甲醇溶液稀释至刻度，制成质量浓度为14.96 μg/mL的乌头碱对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液 2，3，6，10，15 μL，按拟订色谱条件进样分析，以峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=989 736.51X+757.10，r=0.999 9(n=5)。结果表明，乌头碱进样量在0.029 92～0.224 4 g范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:精密吸取乌头碱对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0.40%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取样品(青海省藏医院)适量，依法制备供试品溶液，分别于制备0，2，4，8，12，24h 时进样 10μL，测定峰面积。结果的RSD为1.14%(n=6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

重复性试验:取同一样品(青海省藏医院)6份，依法制备供试品溶液，各进样10 μL，测定峰面积。结果的 RSD为1.24%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品约2.5 g，精密称定，加入一定量的乌头碱对照品，按供试品溶液制备方法制备待测溶液，依法进样测定乌头碱含量，计算回收率。结果见表1。

表1 乌头碱加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取二十五味儿茶丸样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

取乌头碱对照品溶液和供试品溶液，分别进样分析，在190～400 nm波长范围内测吸光度。结果与头碱在232.7 nm处有最大吸收，故选择233 nm作为检测波长。

在提取二十五味儿茶丸中乌头碱时，曾采用酸提乙醚萃取法、氨水乙醚超声提取法，结果后者简便、快速，且提取率较高，超声30min即可将样品中的乌头碱提取完全。曾比较了不同氨试液量对乌头碱提取率的影响，结果以4 mL氨试液、超声提取效率最高。

参考文献：

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