响应面分析法优化白术多糖超声提取工艺

郑莹丽，杨朝霞，佘高照，张 春，张朝晖

(1.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000； 湖南省龙山县现代中药材开发有限公司，湖南 龙山 416800)

白术为我国常用中药之一，为菊科植物白术的干燥根茎，常用于治疗脾胃气弱、泻泄和胎动不安等疾病[1]。近年来的研究发现，白术多糖具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和降血糖等作用[2]，其提取研究对于开发白术多糖资源具有重要意义。目前，白术多糖的常用提取方法主要有热水浸提、稀酸浸提、稀碱浸提等传统方法[3]。近年来，各种新的提取工艺也有应用，如酶法提取[4]、微波提取[5]和超声提取[6]等。超声提取技术具有提取时间短、能耗低、效率高等特点[7]，刘胜姿等[8]成功验证了超声提取白术多糖的工艺。但采用响应面设计优化白术多糖超声提取工艺的报道很少。本研究中主要在传统水提法基础上，以武陵山区龙山白术为原料，辅助超声波处理，利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎，促进胞内多糖的溶出，缩短提取时间[9]。并以白术多糖得率为评价指标，在原料颗粒提取时间、提取温度、料液比等单因素试验基础上，利用响应面分析法[10]优化超声波提取白术多糖的工艺条件，为开发利用白术多糖资源及工业化生产提供理论依据。

1 仪器与试药

UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DF-101S型集热式磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；JA2003N型电子天平(上海精密仪器厂)。白术(龙山现代中药材开发有限公司，批号为1204003)；70%乙醇(成都金山化学试剂有限公司)；苯酚、浓硫酸(湖南省邵阳市方华化工有限公司)；氯仿(武汉点达有限公司)，正丁醇(南京东方之珠有限公司)；无水葡萄糖标准品(中国药品生物制品检定所，批号为110833-200902)；蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺流程及提取方法

工艺流程:白术→粉碎(过20目筛)→70%乙醇回流→抽滤得白术颗粒→加蒸馏水→超声辅助浸提→抽滤得滤液→定容→测定多糖含量。称取白术颗粒5.0 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加70%乙醇100 mL，85℃加热回流1.5 h，过滤所得白术颗粒用10 mL 70%乙醇洗涤2次。收集白术颗粒，加入75 mL蒸馏水，80℃超声辅助提取70 min，趁热抽滤，残渣用10 mL蒸馏水洗涤2次，滤液于250 mL容量瓶中定容。用紫外-可见分光光度计分析测定白术多糖的含量。

2.2 白术多糖得率测定

标准曲线绘制:称取无水葡萄糖0.332g，精密称定，置1000mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加水至2.0 mL，再加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出，置冷水中冷却10 min。同时取2.0 mL蒸馏水做空白，用紫外-可见分光光度计在490 nm波长处测定吸光度，将上述数据进行线性回归，得标准曲线方程 A=16.81C+0.029，r=0.999 7，式中 C为标准溶液质量浓度(g/L)，A为吸光度。

测定方法:采用苯酚-硫酸法[11]，精密吸取0.2 mL样品溶液，置50 mL容量瓶中，加水稀释定容。然后精密量取2.0 mL，置试管中，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出，置冷水中冷却10 min，同时用2.0 mL蒸馏水作空白，用紫外-可见分光光度计在490 nm波长处测定吸光度。多糖得率(%)=(比色液质量浓度×比色液体积×定容体积)/(供试样品体积×供试样品质量×103)×100%。

2.3 超声波提取工艺单因素试验结果

称取一系列干燥过筛后的白术颗粒5.0 g，分别置250 mL锥形瓶中，加入蒸馏水，超声辅助提取，趁热抽滤，残渣用10 mL蒸馏水洗涤2次，得滤液，滤液置250 mL容量瓶中定容，采用苯酚-硫酸法检测溶液中白术多糖含量，探讨各因素对白术多糖得率的影响。

颗粒度:固定超声提取温度为80℃，在料液比为1∶15下超声提取时间70 min，分别对过8，20，40，60目筛的白术颗粒进行提取，研究不同粒度对白术多糖得率的影响。结果见图1 A。可见，白术原料颗粒度对白术多糖得率有显著影响，原料越细小，浸提越充分，提取得率越高。但由于白术含有大量淀粉，若颗粒太细，进行提取时，淀粉溶出提取液会成糊状，影响白术多糖含量的测定。综合生产周期和试验操作，颗粒度选取过20目筛较好。

料液比:固定超声提取温度为80℃，提取时间为70 min，采用料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30对过 20 目筛的白术颗粒进行提取。结果见图1 B。随着料液比的增加，多糖得率随之增加，到1∶15时多糖得率达到最高。再增加溶剂比例，多糖得率无明显变化。这是因为在粗多糖的提取过程中，随着溶剂用量的增加，物料的溶出量逐渐增加，达到饱和溶出度后，多糖得率不再改变。从实际生产操作条件和成本考虑，加水量不宜过大，故料液比以1∶15为宜。

提取温度:固定料液比1∶15，白术颗粒粒度为20目筛，超声提取时间为 70 min，分别在 40，50，60，70，80，90，100 ℃下研究不同温度对白术多糖得率的影响。结果见图1 C。随着温度的升高，多糖的得率不断升高，80℃达到最高，其原因可能是温度过高会使多糖产生降解，从而导致多糖得率下降。同时，高温对多糖的结构与活性也会产生一定的影响，故最佳提取温度应为80℃。

提取时间:固定提取温度为80℃，料液比为1∶15，分别在40，50，60，70，80，90 min 下研究提取时间对过 20 目筛的白术多糖得率的影响。结果见图1 D。随着超声提取时间的增加，多糖的得率不断升高。在70 min后随着时间的延长，多糖得率曲线基本平缓，这表明白术多糖基本提取完毕。从节省能源和减少生产周期考虑，提取时间以70 min为宜。

2.4 响应面优化试验

Box-behnken试验结果:为了进一步研究超声提取的工艺条件，该试验采用响应面分析法优化超声提取参数。根据Box Benhnken中心组合试验设计原理[10]，综合前述单因素试验结果，选取提取温度(A)、料液比(B)、提取时间(C)3 个因素，采用 3 因素3水平响应面分析法进行试验。分析因素与水平设计见表1，响应面分析方案及结果见表2。利用SAS8.1软件对上表中数据进行二次线性回归拟合和显著性分析，分析结果见表3。回归拟合数学模型为，Y=12.41400+0.258 75 A+0.45125 B+0.235 00C+0.14500AB-0.077500AC+0.11750BC-0.49200A2-0.37200B2-0.719 50C2。由表3可见，料液比与超声时间的交互项对多糖得率影响显著，温度的二次项对多糖得率影响显著，超声时间的二次项对多糖得率影响显著。该模型的 R=0.979，R值越接近1，拟合度越高，表明该模型对试验的拟合较好。故影响因素顺序为温度＞超声时间＞料液比。

图1 白术多糖得率影响因素考察

白术多糖提取的响应面分析:白术多糖提取工艺，用SAS 8.1软件进行响应面分析，得到响应曲面图及等高线图，确定最优提取条件，提取时间为70.16 min，提取温度为80.26℃，料液比为1∶15.61。结合实际生产中操作条件，超声提取白术多糖的最优条件可优化为提取时间70 min，提取温度80℃，料液比1∶15。在最优条件下进行的5组平行试验，得到白术多糖得率分别为12.47%，12.42%，12.38%，12.39%，12.56%，平均值为12.44%，与预测值12.54%相差0.10%。因此，该模型能很好地预测结果。

表1 响应面分析因素与水平表

表2 响应面分析试验方案及结果

表3 回归方程的方差分析结果

2.5 白术多糖提取方法比较

根据文献报道[9]并结合实际，以多糖得率作为衡量提取效率的指标，称取5.0 g过20目筛的白术颗粒，在提取温度为90℃、料液比为1∶20的条件下进行热水浸提6 h，将所得物进行抽滤，得滤液。滤液用70%的乙醇沉淀24 h，将其进行离心，即得到多糖粗品，采用苯酚-硫酸法对产品中白术多糖进行检测，多糖得率最高可达7.59%。

比较水提法和超声辅助提取法，可知超声辅助提取白术多糖能大大缩短提取时间，在最佳条件下白术多糖得率也比热水提法的多糖得率高。因此，超声辅助提取法明显优于水提法。

3 讨论

通过单因素试验，以及在此基础上通过设计3因素3水平响应面分析法试验，最终确定出超声提取白术多糖的最佳工艺参数:颗粒度为20目，料液比为1∶15，提取温度为80℃，提取时间为70 min。在此条件下，白术多糖得率达12.44%。

参考文献：

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[11]邱细敏，卢岳华，沈 品，等.不同产地白术多糖含量测定[J].中国药业，2005，14(4):40-41.