HPLC法同时测定人血浆中拉米夫定、齐多夫定和奈韦拉平的浓度Δ

邹尚荣，李燕青，周波，简凤璧，陈谐捷（.广州市第八人民医院药剂科，广州 50060；.广州市第八人民医院感染科，广州 50060）

高效抗逆转录病毒治疗（Highly active anti-retroviral therapy，HAART）是目前抗人类免疫缺陷病（HIV）治疗的最有效和最主要的措施。初治HIV感染/艾滋病（AIDS）患者治疗推荐方案为2种核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）+1种非核苷类转录酶抑制剂（NNRTIs）或2种NRTIs+1种加强型蛋白酶抑制剂（PIs）（含利托那韦）[1]。拉米夫定（Lamivudine，3TC）、齐多夫定（Zidovudine，AZT）、奈韦拉平（Nevirapine，NVP）三者合用是我国目前抗HIV治疗常用的三联用药方案之一，前两者属于NRTIs，而后者属于NNRTIs。为便于临床进行血药浓度监测和开展药动学研究，本试验以甲硝唑（Metronidazole）为内标，建立了同时测定人血浆中3TC、AZT和NVP浓度的高效液相色谱（HPLC）法。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，包括G1314B型紫外检测器、Agilent色谱化学工作站（美国Agilent公司）；XW-B型涡旋混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；AL204型电子天平（瑞士Mether Toledo公司）；5417R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；B320A型离心机（北京白洋医用离心机有限责任公司）；DZF-6021型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

3TC对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号:101007-200701，纯度＞99.7%）；AZT对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号:100672-200401，纯度＞99.5%）；NVP对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号:100641-200401，纯度＞99.5%）；内标:甲硝唑（安徽双鹤药业有限责任公司，批号:1209205D）；乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，水为双重蒸馏去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-水（梯度洗脱程序:0～10min为5∶95，10.1～18.8min为25∶75）；流速:0.8ml/min；柱温:30 ℃；检测波长:268nm；进样量:30 µl。

2.2 对照品贮备液的制备

准确称取3TC、AZT、NVP对照品各适量，分别置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度为1mg/ml的对照品贮备液，贮存于4℃冰箱内避光保存备用。试验前按需用乙腈-水（10:90）混合液稀释至相应浓度并混合成3TC-AZT-NVP标准溶液。

2.3 内标贮备液、内标溶液的制备

准确称取甲硝唑适量置于10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为1mg/ml的内标贮备液，贮存于4℃冰箱内避光保存备用。试验前用乙腈-水（10∶90）混合液稀释成浓度为30µg/ml的内标溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取含药血浆0.25ml，置2.0ml离心管中，加入内标溶液（30µg/ml甲硝唑溶液）50µl，涡旋振荡3 s，再加入乙腈0.75ml，密塞，涡旋振荡1min，以离心半径为8 cm、转速为14000 r/min离心10min。吸取上清液置5.0ml的离心管内，加入乙酸乙酯3.0ml，密塞，涡旋振荡1min，以离心半径为8 cm、转速为5000 r/min离心10min。吸取上清液置5.0ml的离心管内，真空干燥（42℃）至干。进样前加入乙腈-水（10∶90）200µl，涡旋振荡10 s溶解残渣，以离心半径为8 cm、转速为5000 r/min离心10min，吸取30µl上清液进样分析。

2.5 专属性考察

取空白血浆0.25ml置2.0ml锥形离心管中，除不加内标外，按“2.4”项方法操作，按“2.1”项色谱条件测定，获得空白血浆样品的色谱图，见图1A；将一定浓度的3TC-AZT-NVP混合标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，同法操作获得色谱图1B，3TC、AZT、NVP和甲硝唑分别在6.1、14.4、17.7、11.2min出峰；取HIV感染者同时口服3TC片（艾息®，安徽贝克生物制药有限公司）、AZT片（克度®，东北制药总厂）及NVP片（艾太®，浙江华海药业股份有限公司）后收集的血浆样品，同法操作，得色谱图1C。由图1可见，3TC、AZT、NVP及内标的测定不受血浆中内源性物质的干扰，本方法具有较高的专属性。

图1 典型色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+3TC（1 µg/ml）+AZT（1 µg/ml）+NVP（2 µg/ml）+甲硝唑（6µg/ml）；C.受试者口服3TC片（300mg）、AZT片（600mg）和NVP片（400mg）后收集的血浆样品；1.3TC ；2.甲硝唑；3.AZT；4.NVPFig 1 Typical chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+3TC（1 µg/ml）+AZT（1 µg/ml）+NVP（2 µg/ml）+metronidazole（6 µg/ml）；C.plasma after taking 3TC tablet（300mg），AZT tablets（600mg）and NVP tablets（400mg）orally；1.3TC；2.metronidazole；3.AZT；4.NVP

2.6 标准曲线及定量下限考察

取空白血浆0.25ml，分别加入同时含有质量浓度为0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 µg/ml 3TC，0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 µg/ml AZT以及0、0.5、1、5、10、50、80、100 µg/ml NVP的3TC-AZT-NVP混合标准溶液50μl，振荡3 s，使3TC血药浓度相当于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 µg/ml，AZT血药浓度相当于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 µg/ml，NVP血药浓度相当于0、0.1、0.2、1、2、10、16、20 µg/ml。其余项按“2.4”项方法处理，进样测定，记录色谱。以药物峰面积与内标甲硝唑峰面积之比（y）对药物血浆浓度与内标甲硝唑浓度之比（x）进行线性回归，分别得3TC、AZT、NVP回归方程为:y＝2.095x+0.0187（r＝0.9981，n＝7）；y＝2.7668x+0.0218（r＝0.9990，n＝7）；y＝2.1348x+0.0162（r＝0.9983，n＝7）。结果表明，三者血药浓度分别在0.05～10、0.05～10、0.1～20µg/ml范围内线性关系良好；定量限分别为0.05、0.05、0.1 µg/ml。

2.7 精密度及方法回收率试验

按“2.6”项方法分别配制低（3TC 0.1 µg/ml、AZT 0.1 µg/ml、NVP 0.2 µg/ml）、中（3TC 1 µg/ml、AZT 1 µg/ml、NVP 2 µg/ml）和高（3TC 8 µg/ml、AZT 8 µg/ml、NVP 16 µg/ml）质量浓度的3TC-AZT-NVP血浆质控样品各15份，分为3批，每批5份，每批随行标准曲线，依“2.4”项方法处理后，按“2.1”项色谱条件进样测定，计算质控样品的浓度。将测得量与配制量对照，考察本法的准确度（方法回收率）和精密度，结果分别见表1、表2及表3。结果表明，本法测定血浆中3TC、AZT与NVP浓度的准确性与精密度高、重现性好。

2.8 提取回收率试验

分别配制低（3TC 0.1 µg/ml、AZT 0.1 µg/ml、NVP 0.2 µg/ml）、中（3TC 1 µg/ml、AZT 1 µg/ml、NVP 2 µg/ml）和高（3TC 8µg/ml、AZT 8 µg/ml、NVP 16 µg/ml）质量的 3TC-AZT-NVP血浆质控样品，处理后测定，以所得峰面积与相应浓度对照品溶液直接进样所得峰面积比较，计算提取回收率，结果分别见表1、表2及表3。结果表明，3TC、AZT与NVP低、中、高3个浓度的提取回收率对测定结果影响程度基本一致。

表1 3TC回收率与精密度试验结果Tab 1 Results of recovery and precision tests of 3TC

表2 AZT回收率与精密度试验结果Tab 2 Results of recovery and precision tests ofAZT

表3 NVP回收率与精密度试验结果Tab 3 Results of recovery and precision tests of NVP

2.9 稳定性试验

按“2.6”项方法分别配制低（3TC 0.1 µg/ml、AZT 0.1 µg/ml、NVP 0.2 µg/ml）、中（3TC 1 µg/ml、AZT 1 µg/ml、NVP 2 µg/ml）和高（3TC 8 µg/ml、AZT 8 µg/ml、NVP 16 µg/ml）质量的3TC-AZT-NVP血浆质控样品，分别考察经室温避光放置1 h和24h、冻融1次和3次、－20℃冻存3 d和7 d的稳定性。结果3种血药浓度3TC、AZT和NVP在上述条件下的RSD值均＜15%，符合方法学要求。

2.10 临床样本检测

从我院HIV门诊抽取9例HIV/AIDS患者的血浆，这些患者均服用3TC-AZT-NVP治疗方案且达半年以上。血浆样本按“2.4”项方法处理后，按“2.1”项色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 HIV/AIDS患者血浆3TC-AZT-NVP浓度测定结果Tab 4 Determination results of 3TC-AZT-NVP blood concentration of HIV/AIDS patients

3 讨论

HAART是全球公认为现今抗病毒治疗HIV感染/AIDS最主要的有效措施，但所用药物在有效抑制病毒复制的同时，毒副反应较大、耐药及个体差异等问题突出。通过治疗药物监测（TDM）指导临床个体化合理用药，提高抗病毒治疗效果和患者的依从性，尽可能避免过高药量导致的毒副作用和偏低药量诱发耐药等情况则显得尤为重要。

同时检测血浆中3TC、AZT、NVP浓度的方法，有HPLC-紫外（UV）法[2]和液-质联用（LC-MS/MS）法[3-4]。LC-MS/MS法灵敏度高，但设备较昂贵，难将其常规应用于二、三级医院的TDM。HPLC法稳定性好、成本较低，可满足抗HIV药物临床监测的需要，故本研究意在探寻HPLC-UV法同时测定3种常用抗HIV药物浓度的优选方法，并用于TDM。

根据文献[5]，3TC、AZT、NVP的最大吸收波长分别为275、268、282nm。最大吸收波长处的响应值（AU）从大到小分别为NVP、3TC和AZT。综上，比较三者在268、273、278nm波长处的响应值:3TC在268nm与273nm波长处AU相近且大于其在278nm处AU；AZT在268nm波长处AU为三波长中最高；NVP虽在268nm波长处AU为中值，但亦为此处3TC及AZT AU的6～7倍。为使三者均有较好响应，故确定268nm为本研究方法的检测波长。

将法莫替丁、司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等作内标考察，发现司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奥硝唑在本方法的色谱条件下有较强吸收，但唯有甲硝唑的出峰时间最合适，且介于3TC和AZT之间、分离度好、内源性物质不干扰，故确定甲硝唑为内标。

3TC极性强，NVP极性弱，AZT极性介于两者之间。单用乙腈、乙酸乙酯或叔丁基甲醚提取，难达到理想提取效果。用乙腈-乙酸乙酯混合体系（2∶1、1∶1、1∶2）作提取溶剂，3种目标药物及内标皆能被提取。但仅采用一步液-液萃取后杂质始终较多，且杂质会随乙腈比例的增加而增加。故采取先用乙腈沉淀后再对上清液用乙酸乙酯进行萃取的方法，结果显示杂质明显减少，提取效果较好。

AIDS患者常因HAART和机会性感染治疗而需同时服用较多药物。本方法对9例门诊临床样本进行检测，3种目标药物及内标皆无干扰（见图1C），证明本法可应用于AIDS患者TDM。由表4可知，患者的3TC-AZT-NVP血药浓度存在较明显个体差异，有必要对HAART进行TDM以确保疗效稳定。

本方法仅需用0.25ml血浆，低于文献报道的0.50ml[2]，无需固相萃取[3]，对检测设备要求不高[3-4]，操作简单、快速、灵敏，检测结果准确、重复性好，是临床常规开展3TC、AZT和NVP血药浓度同时监测及药动学研究的优选方法。

[1]中华医学会感染病学分会艾滋病学组.中华医学会第五次全国艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全国热带病学术会议论文汇编[C].2011:44.

[2]Nandi U，Das A，Roy B，et al.Development and validation of an HPLC-UV method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine，and nevirapine in human plasma and its application to pharmacokinetic study in human volunteers[J].Drug Test Anal，2013，5（6）:485.

[3]Kumar VR，Reddy BR，Sreekanth K，et al.High throughput LC-MS/MS method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine and nevirapine in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013（921/922）:9.

[4]李周，丁存刚，葛庆华，等.人血浆中拉米夫定、齐多夫定、奈韦拉平的LC-MS/MS法测定[J].中国医药工业杂志，2010，41（3）:200.

[5]Herve R，Bernard M，Corinne C，et al.Determination of 19 antiretroviral agents in pharmaceuticals or suspected products with two methods using high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr B，2007，850:376.