hMMS2基因对结肠癌细胞耐药逆转的影响

张蕾, 隋御, 王婷, 李利坚, 李元杰, 金彩霞, 徐方

1. 宁夏医科大学检验学院, 宁夏生殖与遗传重点实验室, 银川 750004;

2. 同济大学医学院转化医学研究中心, 上海 200072

hMMS2基因对结肠癌细胞耐药逆转的影响

张蕾1, 隋御1, 王婷1, 李利坚1, 李元杰1, 金彩霞2, 徐方1

1. 宁夏医科大学检验学院, 宁夏生殖与遗传重点实验室, 银川 750004;

2. 同济大学医学院转化医学研究中心, 上海 200072

为探讨hMMS2(Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)基因对人结肠癌细胞耐药逆转的影响,文章以人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞(THC8307/L-OHP)为实验材料, 采用脂质体-质粒转染技术构建了带有干扰目的基因hMMS2的miRNA片段并携带绿色荧光蛋白标记重组质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的细胞系, 通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)和免疫荧光技术(Immunostaining technique)检测该细胞系的干扰效率。选择 hMMS2低表达具有统计学意义的上述细胞系作为实验组细胞, 同时将未曾作过处理的 THC8307/ L-OHP细胞作为空白对照组, 转染绿色荧光蛋白空质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR)的 THC8307/L-OHP细胞作为阴性对照组, 以噻唑蓝比色分析实验(MTT colorimetric analysis assay)、克隆形成实验(Colony formation assay)对 3组细胞的存活率和克隆形成率进行检测, 结果显示：实验组细胞的奥沙利铂半数抑制浓度(Half inhibition concentration, IC50)、耐药指数(Resistance index, RI)及克隆形成率(Colony-forming efficiency, CFE)均比对照组细胞明显降低(P＜0.05), 而相对逆转率(Relative reverse efficiency, RRE)增高(P＜0.05), 提示实验组细胞增殖能力减弱; 以罗丹明123实验(Rhodamine 123 assay)结合倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测技术等观测细胞的凋亡变化, 结果显示, 实验组细胞的凋亡率较对照组细胞显著增高(P＜0.05); 两对照(空白、阴性)组间并无细胞增殖或凋亡的显著性差异。研究结果提示：下调hMMS2基因表达可逆转人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞对L-OHP的耐药性并促进结肠癌细胞的凋亡。

RNA干扰; 铂类耐药; hMMS2; 人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞(THC8307/L-OHP); 细胞凋亡

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 随着经济的发展和生活方式的改变, 其患病率也逐年上升, 严重危害人类生命健康[1]。化疗是结肠癌综合治疗的重要手段, 其中奥沙利铂(Oxaliplatin, L-OHP)是临床上治疗结肠癌最常用的化疗药物, 尤其对于中晚期结肠癌的治疗及预防复发转移具有重要的意义。临床上肿瘤的化疗是一个多种药物联合使用的漫长过程, 随着大剂量多种药物的同时使用, 细胞的多药耐药(Multidrug resistance, MDR)问题也随之产生, 并且成为结肠癌等恶性肿瘤细胞治疗中“攻而未解”的难题[2]。随着分子生物学技术手段的发展,以RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术调控目的基因表达来实现细胞的耐药性逆转成为肿瘤治疗的一条新思路。本课题组曾对铂类药物耐药分子机制密切相关的跨损伤DNA合成系统[3](Translesion DNA synthesis, TLS)进行了研究, 将该系统的易误修复途径(Error-prone repair, EPR)中的关键基因 REV3L (REV3-like, polymerase (DNA directed), zeta, catalytic subunit)作为靶基因, 研究其与逆转结肠癌的耐药性关系[4], 为更深入地探讨多药耐药性提供相应的支持与保障。本文继续这一思路, 对该系统的无误修复途径(Error-free repair, EFR)的关键基因 hMMS2 (Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)与逆转结肠癌的耐药性进行研究。hMMS2基因属于RAD6上位群基因[5], 在细胞分化及肿瘤的发生中扮演着重要角色, 它编码一种泛素缀合酶样蛋白, 其氨基酸序列及二、三级结构类似于泛素缀合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme)[6]。国内外相关研究表明：通过抑制DNA聚合酶ζ或者跨损伤修复途径, 可逆转卵巢癌、肺癌等多种肿瘤耐药细胞的耐药性[7～10]。目前, 主要开展了 polη介导的无误性修复途径和polζ介导的易误性修复途径与铂类耐药性关系的研究。本研究通过下调人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞(THC8307/L-OHP)的hMMS2基因表达, 检测其相应的细胞增殖和凋亡变化情况, 以此来评价目的基因、铂类药物与细胞耐药性形成和逆转之间的关系, 为临床肿瘤治疗提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

人高分化结肠癌细胞系(THC8307)及人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞系(THC8307/L-OHP)由天津医科大学生命科学中心实验室汤华教授建立并惠赠。

1.2 方法

1.2.1 hMMS2 miRNA的构建

根据GenBank hMMS2基因(NM_003350)已知序列的基因信息, 设计 miRNA的靶序列: 5′-TGCTGTTACGAGGAACTTTAACTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGTTAGTTCCTCGTAA-3′, 反义链为5′-CTGTTACGAGGAACTAACTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAGTTAAAGTTCCTCGTAAC-3′,将设计合成的 miRNA oligos复性连接至 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体, 构建完成的hMMS2基因沉默载体经转化 DH5α感受态细胞后, 选取阳性克隆纯化后送上海松正生物科技有限公司进行测序。

1.2.2 细胞培养与转染

THC8307(亲本系)常规培养, THC8307/L-OHP (耐药系)需加入 6 µg/mL的奥沙利铂(南京制药厂,产品批号：20100602)维持其耐药性。实验前1周耐药细胞需撤去药物常规培养。取对数生长期的细胞进行转染, 按 LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogene公司)说明书进行操作。实验分3组进行：①空白对照组：未经任何处理的THC8307/L-OHP细胞; ②阴性对照组：为转染阴性空质粒(pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR)的THC8307/L-OHP细胞; ③实验组：为转染实验组质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的THC8307/L-OHP细胞。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测细胞hMMS2基因的表达量

将亲代THC8307及3组耐药THC8307/L-OHP细胞(空白对照组、阴性对照组、实验组), 分别于37℃、5%CO2条件下培养 24 h 后在倒置荧光显微镜下观察转染情况及细胞形态变化。再继续培养24 h后, 1 000 r/min 离心收集上述3组耐药细胞及亲代细胞 THC8307, 按总 RNA提取试剂盒说明书提取RNA, 反转录合成 cDNA, 并利用实时荧光定量PCR检测各组细胞目的基因的相对表达量。qRT-PCR扩增体系：10 µg/mL的样品cDNA 5 µL, 2×Real-time PCR Master Mix 12.5 µL, 上、下游引物各 0.5 µL, 去离子水 6 µL, Passive Reference Dye (PRD) 0.5 µL, 总反应体系 25 µL。根据 NCBI中GenBank公布的 cDNA序列(NM_003350), 应用软件Primer 5设计扩增hMMS2基因的引物。上游引物：5′-CGGTCTCCACAGGAGTTAAAGT-3′; 下游引物：5′-TGTCCAGGTCATGTTTACCAGC-3′。为避免基因组DNA污染, 引物设计原则为上、下游引物跨两个外显子[11]。内参基因GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′, 下游引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。qRT-PCR扩增条件为：95℃ 3 min; 93℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。3次实验所得数据通过比较CT值法( 2-ΔΔCT) 进行相对定量分析。

1.2.4 免疫荧光技术检测转染后 THC8307/L-OHP细胞 MMS2蛋白表达的变化

细胞转染 48 h后, 各组细胞按 4 ×105/ mL、2 mL/孔接种于6孔板中; 4%多聚甲醛固定细胞10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 0.5%TritonX-100对细胞透化处理10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 10%山羊血清封闭30 min, PBS洗3遍; 滴加1∶200一抗(兔抗人MMS2单克隆抗体, 美国abcam公司), 4℃过夜, PBS洗3遍, 每次5 min; 滴加1:100二抗(FITC标记山羊抗兔 IgG, 北京中杉金桥生物技术有限公司), 37℃孵育 l h, PBS洗3遍, 每次5 min; 加入0.5 µg/mL DAPI (DAPI染色试剂盒, 南京凯基生物科技发展有限公司)染色10 min, PBS 洗3遍, 在避光条件下, l h内倒置荧光显微镜下拍照并分析结果。

1.2.5 MTT 法(噻唑蓝比色分析实验)检测转染后THC8307/L-OHP细胞的增殖活性

取THC8307及转染24 h后的THC8307/L-OHP各组细胞5×104/孔接种于96孔板中, 设5个药物浓度梯度：0.06 µg/mL、0.6 µg/mL、6 µg/mL、60 µg/mL和600 µg/mL, 加入100 μL/孔。培养48 h后, 按MTT试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)说明书操作, 在酶联免疫检测仪上测OD490值, 取5个复孔的平均吸光度(OD)值, 每组重复 3次, 根据吸光度报告计算细胞存活率(%)=OD加药组/ OD对照组×100%, 细胞生长抑制率(%)=1-细胞存活率=1-OD加药组/ OD对照组× 100%, 运用改良寇氏法(改良Logit法)确定奥沙利铂对各组细胞的半数抑制浓度(Half inhibition concentration, IC50), 进一步计算出耐药指数(Resistance index, RI)=耐药细胞 IC50/亲本细胞 IC50和相对逆转效率(Relative reverse efficiency, RRE)=(未转染组IC50-转染组 IC50)/(未转染组 IC50-亲本细胞 IC50) ×100%。

1.2.6 Rh123单染法检测转染后 THC8307/L-OHP细胞凋亡情况

取上述转染24 h后的各组THC8307/L-OHP细胞按4×105个/孔接种与六孔板中, 培养24 h后收获细胞悬液, 按罗丹明 123试剂盒(Rh123, 南京凯基生物科技发展有限公司)染色细胞, 在同一曝光率下,倒置荧光显微镜观察各组细胞的形态及其荧光强度,并以IPP 6.0软件统计平均荧光强度。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后

THC8307/L-OHP细胞联合L-OHP的凋亡率

取上述转染24 h后的THC8307/L-OHP各组细胞, 调整浓度至4×105/mL, 以2 mL/孔接种于 6孔板, 培养24 h后加入终浓度为 60 µg/mL L-OHP, 置于 37℃、5%CO2条件下继续培养16 h, 分别收集各处理组细胞, 按 Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)操作说明采用AV/PI双染, 避光放置10 min, 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.8 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力和细胞增殖情况

转染24 h后, 将3组THC8307/L-OHP细胞按50、100、200、500、1000、2000的细胞密度分别接种于3个6孔板中, 向相应每孔中分别加入0 µg/mL、0.06 µg/mL、0.6 µg/mL、6 µg/mL、60 µg/mL 和600 µg/mL浓度的奥沙利铂, 常规培养10 d后, 甲醇固定15 min、姬姆萨染色30 min, 肉眼计数含有50个细胞以上、直径＞ 0.5 mm 的克隆数量, 计算细胞克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.9 微核的测定检测基因表达改变所致的遗传不稳定现象

细胞转染48 h后取出各组细胞各一皿, PBS冲洗后, 姬姆萨染色, 镜检。在高倍镜下, 选择细胞均匀的视野, 随机选取1000个完整的细胞, 计数所含微核的细胞数。微核的判断标准：分布在主核边、形态为圆形或椭圆形, 并且染色与主核相同但又独立于主核的、大小约为主核的1/20～1/4的微小核。

1.3 统计分析

所有实验均重复 3 次, 所有数据均用 SPSS 16.0 软件分析, 以均数±标准差表示, 组间比较采用单因素方差分析(SNK 法), P＜0.05 为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 hMMS2基因沉默载体的测序结果

构建完成的hMMS2基因沉默载体经转化DH5α感受态细胞后, 取阳性克隆纯化后进行测序, 经比较, 测序结果与设计序列相同, 表明 pre-miRNA 片段完整正确地插入到载体 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR 中, 提示针对靶基因hMMS2的miRNA干扰质粒构建成功。

2.2 干扰效能鉴定

2.2.1 hMMS2基因在细胞中表达的变化

qRT-PCR 检测结果显示：THC8307/L-OHP细胞中hMMS2的相对表达量是THC8307细胞的(3.24 ± 0.78), 显著高于敏感株细胞中的表达量(P＜0.05,图 1A) , THC8307/L-OHP细胞转染含hMMS2-miRNA实验组质粒 24 h 后, 细胞中hMMS2基因的相对表达量是THC8307/L-OHP细胞的(0.302 ± 0.136) (P＜0.05); 转染阴性空质粒细胞的相对表达量是THC8307/L-OHP细胞的(0.923±0.256) (P＞0.05, 图1B)。结果表明：小RNA干扰片段成功抑制实验组细胞hMMS2基因的表达, 而空质粒对hMMS2基因表达无大影响。

图1 qRT-PCR检测hMMS2基因在细胞中的表达A: qRT-PCR检测hMMS2 在THC8307 和THC8307/L-OHP细胞中的表达(将THC8307表达量设为100%); B: qRT-PCR检测hMMS2 在转染THC8307/L-OHP 细胞后的表达。K：空白组; Y：阴性组; S：实验组; 将空白组表达量设为100%; *表示P＜0.05。

2.2.2 MMS2蛋白在细胞内表达水平的测定

IPP 6.0软件分析各组细胞平均荧光强度显示(表 1), 实验组与对照组相比, MMS2蛋白表达显著降低(P＜0.05)。在蛋白水平上证明基因下调成功(图2)。

表1 各组细胞的平均荧光强度

图2 倒置荧光显微镜观察MMS2蛋白在细胞中的表达(400倍)

2.3 下调hMMS2基因后THC8307/L-OHP细胞对L-OHP敏感性的变化

MTT法检测发现(表 2), 实验组与两对照组比较, RI值明显降低, 而相对逆转率明显增高(P＜0.05)。从图 3可以看出, 经48 h连续给药(L-OHP)处理后,均可抑制各组细胞生长增殖并呈浓度依赖性。在同一药物浓度下, 实验组细胞抑制率较两对照组显著升高, 说明下调 hMMS2基因可以抑制 THC8307/ L-OHP细胞的生长, 提高 THC8307/L-OHP细胞对化疗的敏感性。

图3 不同剂量的L-OHP对各组细胞的杀伤作用

表2 各组细胞对L-OHP的敏感性

2.4 下调hMMS2基因对细胞凋亡的影响

2.4.1 Rh123荧光染色

同一视野和曝光率下, 各组细胞荧光照片, 两对照组细胞形态完整, 染色均匀; 实验组多为凋亡细胞, 形态出现残缺, 染色不均匀(图4)。IPP 6.0分析平均荧光强度显示(表3)：基因下调组平均荧光强度强于空白组和阴性对照组(P＜0.05), 空白组和阴性对照组无明显统计学差异(P＞0.05)。结果表明：hMMS2基因下调后促进结肠癌细胞凋亡。

2.4.2 流式细胞术分析 Annexin V-FITC/PI荧光染色结果

图4 倒置荧光显微镜观察下调hMMS2基因后Rh123荧光染色细胞形态(400倍)

表3 各组细胞的平均荧光强度

经L-OHP处理16 h后, 流式细胞术结果显示转染组与两对照组相比凋亡率增高, 差异有统计学意义(P＜0.05), 空白组和阴性对照组之间无显著性差异(P＞0.05) (图5, 表4)。结果表明, 沉默hMMS2 基因可通过诱导凋亡增强 THC8307/L-OHP细胞对L-OHP的敏感性。

2.5 基因下调对细胞克隆形成能力和增殖能力的影响

由表5可见, 3组细胞在L-OHP ＞0.6 µg/mL时,随药物浓度增加, 克隆形成率均明显降低, 且转染组较两对照组细胞克隆形成率明显降低(P＜0.05),但600 µg/mL时的差异无统计学意义(P＞0.05), 提示下调 hMMS2基因增加 THC8307/L-OHP细胞对L-OHP的敏感性。

2.6 基因下调对细胞微核产生的影响

实验组细胞微核数值如表6所示：较两对照组细胞的微核数值明显降低, 差别具有统计学意义(P＜0.05), 而两对照组细胞之间微核数值没有统计学差异。提示hMMS2基因可能与微核的产生有关系。

3 讨 论

图5 流式细胞术检测下调hMMS2基因对给予L-OHP处理的THC8307/L-OHP细胞凋亡的影响

表4 流式细胞术测定细胞凋亡率(%,±s)

表4 流式细胞术测定细胞凋亡率(%,±s)

注：实验组与两对照组比较, *P＜0.05; 两对照组比较, P＞0.05。

组别 早期细胞凋亡 晚期细胞凋亡THC8307/L-OHPblank11.48±0.423.92±0.26THC8307/L-OHPcontrol12.93±0.634.27±0.17THC8307/L-OHPhMMS2↓19.76±0.78*6.06±0.34*

化疗是结肠癌治疗的重要手段之一, 然而长时间多种药物的联合使用会产生多药耐药现象, 导致疗效的降低甚至化疗的失败, 铂类耐药现象是结肠癌治疗中较为常见的现象, 因此研究铂类耐药是解决结肠癌耐药的路径之一, 国内外大量的研究已证实跨损伤 DNA合成途径与逆转肿瘤细胞对铂类药物敏感性存在一定的因果关系, 明确了跨损伤DNA合成途径在修复铂类药物引起的 DNA交连损伤中起关键作用[12,13], 可以通过抑制跨损伤 DNA 合成途径来提高铂类化疗敏感性[14]。Albertella等[7]发现polη可以通过跨损伤合成途径帮助肿瘤细胞跨越顺铂引起的损伤, 缺失 polη细胞对顺铂的敏感性显著增加。Doles等[8]通过构建耐药性非小细胞肺腺癌小鼠模型, 运用RNA干扰技术靶向降低mREV3的表达, 肿瘤细胞表现出对顺铂作用的显著增敏。这与Lin等[9]用同样方法进行体外实验的结果一致。同时Okuda等[10]发现易误性修复途径的 REV1L 基因也在修复铂类引起的 DNA 损伤中扮演重要作用, 抑制其表达后, 耐药性卵巢癌细胞对顺铂的敏感性增加 1.5倍。这些研究结果均表明, 可通过抑制跨损伤DNA合成途径的相关基因表达来逆转铂类耐药。尽管对于 hMMS2与铂类耐药性逆转的研究目前开展尚少, 然而 hMMS2与增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)泛素化过程密切相关已是相关实验证明了的事实, PCNA泛素化过程可调控聚合酶的转换, 从而启动跨损伤复制过程[15～17],因此提示 hMMS2与铂类耐药性逆转可能存在一定的相关性。

表5 不同浓度L-OHP作用后细胞克隆形成率(±s)

表5 不同浓度L-OHP作用后细胞克隆形成率(±s)

注：与0 µg/mL组比较, *P＜0.05 ; 实验组与两对照组比较,△P＜0.05; 两对照组比较, P＞0.05。

组别药物浓度(µg/mL) 0 0.06 0.6 6 60 600THC8307/L-OHPblank1.0000.754±0.064*0.746±0.039*0.668±0.066*0.416±0.041*0.021±0.002*THC8307/L-OHPcontrol1.0000.734±0.071*0.706±0.030*0.610±0.029*0.388±0.049*0.024±0.004*THC8307/L-OHPhMMS2↓1.0000.609±0.020*△0.545±0.019*△0.486±0.021*△0.321±0.034*△0.019±0.005*

表6 hMMS2表达量的不同对细胞微核产生的影响

本研究通过 qRT-PCR、MTT、平板克隆形成等实验研究和分析, 发现 hMMS2可能参与了结肠癌细胞的多药耐药形成, 下调 hMMS2基因可以增加THC8307/L-OHP细胞对 L-OHP的敏感度。同时还发现hMMS2体外转染到结肠癌THC8307/L-OHP细胞后, hMMS2低表达可抑制结肠癌细胞的生长, 促进化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用, 提高化疗的敏感性, 并对化疗药物有剂量依赖性。进一步研究发现, 在相同剂量L-OHP作用下, 下调hMMS2 基因表达可以促进结肠癌耐药细胞的自发凋亡, 提示由TLS介导的肿瘤细胞耐药过程中可能有凋亡机制的参与, 这与Philip等[18]发现TLS可使P53凋亡信号通路中的调控分子表达和功能失常引起肿瘤细胞凋亡的报道是一致的。上述实验结果表明下调hMMS2基因的表达对逆转人高分化耐奥沙利铂结肠癌细胞(THC8307/L-OHP)的耐药性有一定影响, 在一定程度上恢复了耐药细胞对化疗药物的敏感性, 或许这是通过抑制 PCNA 的泛素化作用来实现的, 因为hMMS2可与UBC13-RAD5结合形成Rad8Rad5/Mms2-Ubc13复合物对PCNA进行泛素化修饰[16], 而PCNA泛素化修饰主要介导了细胞 DNA 在 S 期的损伤应答作用, 从而降低铂类药物所引起的细胞凋亡,引起铂类耐药性的产生[19]。同时PCNA 泛素化修饰可诱发基因组DNA交连的产生及DNA 高突变[15],这也是铂类药物产生耐药性的关键, 以及在使用过程中加剧机体毒副作用的机制之一[20]。由此可见,下调hMMS2基因一方面可促进结肠癌细胞凋亡, 另一方面又可作为耐药逆转剂, 增加了结肠癌细胞对铂类药物敏感性, 使得化疗药物对肿瘤的杀伤作用增强, 由此可减少化疗药物的剂量, 从而减轻其对机体的毒副作用, 为临床治疗肿瘤提供一种新思路。

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[20] 位全芳. 人 PCNA 泛素化修饰在顺铂诱导的 DNA 损伤应答反应中作用的实验研究[学位论文]. 重庆: 第三军医大学, 2008.

(责任编委: 卢大儒)

Roles of hMMS2 gene in reversing the oxaliplatin tolerance of human colon carcinoma cells

Lei Zhang1, Yu Sui1, Ting Wang1, Lijian Li1, Yuanjie Li1, Caixia Jin2, Fang Xu1

1. Ningxia Key Laboratory of Reproduction and Genetics, College of Inspection, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China;
2. Center for Translational Medicine, School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, China

In this study, the roles of hMMS2 (human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2) gene encoding the hu-man ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 in the drug resistance in human colon carcinoma were investigated by using a well-differentiated human colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line, THC8307/L-OHP. THC8307/L-OHP cells were transfected via liposome along with plasmid pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2 expressing both miRNA against hMMS2 and GFP, followed by real-time fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence to select stable transfectants with significantly reduced hMMS2 expression. Compared with untransfected or pcDNA6.2-GW/EmGFP vector-transfected cells, the hMMS2-depleted cells displayed significantly (P＜0.05) reduced half inhibition concentration(IC50) resistance index (RI) and colony-forming efficiency (CFE) upon treatment with oxaliplatin (L-OHP), while its relative reverse efficiency(RRE) was significantly higher (P＜0.05) than the control cells, indicating compromised ability of cell proliferation. Indeed, Rhodamine 123 staining and flow cytometry analyses revealed an increased rate of apoptosis in hMMS2-depleted cells while no difference in cell proliferation or apoptosis was observed between the two control cell lines. The above observations collectively indicate that suppression of hMMS2 reverses L-OHP tolerance in differentiated human colorectal carcinoma cells by promoting apoptosis.

RNA interference; platinum resistance; hMMS2; human well-differentiated colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line; apoptosis

2013-10-12;

2014-01-29

国家自然科学基金项目(编号：81060170, 31360251); 教育部“春晖计划”项目(编号：Z2011056); 银川市应用研究开发计划项目(编号：银财发(2012)249)资助

张蕾, 在读硕士研究生, 专业方向：DNA损伤与修复。E-mail: 2427084464@qq.com

徐方, 教授, 博士生导师, 研究方向：DNA损伤与修复。E-mail: xufang@nxmu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0346

时间: 2014-3-27 14:33:05

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140327.1433.002.html