黄瓜全基因组热激转录因子(HSFs)的鉴定与表达分析

陈先知, 王燕, 史建磊, 朱隆静, 王克磊, 徐坚

1．温州科技职业学院, 温州 325006;

2．温州市农业科学研究院, 浙南作物遗传育种重点实验室, 温州 325006

黄瓜全基因组热激转录因子(HSFs)的鉴定与表达分析

陈先知1,2, 王燕1,2, 史建磊1,2, 朱隆静1,2, 王克磊1,2, 徐坚1,2

1．温州科技职业学院, 温州 325006;

2．温州市农业科学研究院, 浙南作物遗传育种重点实验室, 温州 325006

热激转录因子 (Heat shock factors, HSFs) 普遍存在于整个生物界。尽管植物HSFs的DNA 结合域具有较高的保守性, 但其结构特征、生物功能具有多样化的特点。本文利用黄瓜(Cucumis sativus L.)全基因组测序结果, 运用生物信息学方法鉴定了黄瓜HSFs, 并对其数量、序列特征、染色体定位以及系统发育关系等进行分析。结果表明, 黄瓜至少含有21个HSFs基因家族成员, 编码184～560个氨基酸, 分子量21.2～62.3 kDa, 等电点(PI)4.70～9.10; 序列比对发现这些成员都具有转录因子特有的DNA结合域(DNA binding domain, DBD); 染色体定位分析表明, 除Csa026480之外, 其余HSFs不均匀分布在黄瓜7条染色体上。从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和黄瓜HSFs系统发育树可以看出, 这些转录因子分为3个分支, 其中Ⅰ分支进一步可分为3类(A、B、C类), 系统发育分析揭示黄瓜HSFs蛋白存在9对直系同源蛋白, 3对旁系同源蛋白, 表明HSF转录因子基因家族的多样化发生在黄瓜和拟南芥分化之前。EST表达分析发现这些热激转录因子参与黄瓜的果实、雌花和两性花的发育与形成; 通过qRT-PCR分析, 发现这些基因在黄瓜苗期应对高温热激响应中表达水平存在显著的差异。研究结果为进一步分析黄瓜热激转录因子奠定了基础。

黄瓜; 热激转录因子; 生物信息学; 耐热性

转录因子又称反式作用因子, 其主要功能是激活或抑制基因的转录, 在调控植物生长发育以及对环境的响应中起重要作用[1]。热激转录因子(Heat shock factors, HSFs)是近年来在植物中发现的一类重要的转录因子, 广泛分布于植物细胞内, 在热胁迫下可以激活热激基因表达, 作为植物转录水平上热胁迫响应基因的中心元件, 在植物热胁迫信号转导以及耐热性调控中起着关键作用[2]。研究表明, 热激转录因子基因和启动子识别序列都是高度保守的。典型的热激转录因子一般包括4个部分：N端的DNA结合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚化结构域(HR-A/B)、细胞核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)、细胞核输出信号(Nuclear export signal, NES), 少数还具有一个 C端激活域 (C-terminal activation domain, CTAD)。植物热激因子通过形成回文发卡结构, 特异地结合高度保守的热激元件, 从而控制热激蛋白的表达[3]。另外, 根据保守DBD和HR-A/B区的结构特点, 热激转录因子又可以分为A、B和C 3类。这三类基因的主要区别表现为：B类基因HR-A/B结构域中A和B结构域之间只有7个氨基酸残基, 在A类和C类中, 除了这7个氨基酸, 还分别有21个和7个氨基酸的插入; 另外, CTAD和NES的结合区域是A类HSFs所特有的结构, B类和C类均不包含CTAD结构域。最早的热激转录因子基因在酵母中被克隆得到, 随后在果蝇(Drosophila melanogaster )和哺乳动物中, 这些热激转录因子也相继被克隆[12]。植物中的热激转录因子基因首先在番茄(Solanum lycopersicum L.)中克隆得到[13], 随后在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中也克隆得到相应基因[14,15], 目前在拟南芥、水稻、玉米(Zea mays L.)、苹果(Malus pumila Mill.)、杨树(Populus adenopoda Maxim.)和大豆(Glycine max L.)中也相继开展了该基因家族的研究[16～20]。番茄(S. lycopersicum)中HSFA1a是调节热激反应(Heat shock response, HSR)的关键因子[4], 同时HSFA2、HSFA3也具有抵抗热激反应的功能[5,6];在拟南芥和向日葵(Helianthus annuus L.)中, HSFA9参与胚胎发育和种子成熟等生命活动[7,8]; 拟南芥HSFA2具有耐热功能[9]; 水稻 HSFA4a则能提高镉的耐受性[10]。大豆HSFA1基因GmHSFA1的过量表达激活或促进其下游 3 个热激蛋白基因的转录或表达, 明显提高了转基因大豆植株的耐热能力[11]。这些研究都表明, 植物 HSFs不仅是植物耐热机制的重要因子, 同时也参与植物重要的生命活动, 对于提高植物抗性具有重要意义。

黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种重要的蔬菜作物, 起源于亚热带或热带, 喜温, 但不耐热, 在夏季栽培或保护地生产中, 高温是影响其产量和品质的主要非生物胁迫因素之一[21]。然而, 目前还未见黄瓜中有关HSFs基因的研究报道。黄瓜全基因组测序工作的完成, 为其遗传育种及相关基因的生物功能鉴定提供了重要的信息参考。本研究利用生物信息学方法, 在黄瓜基因组数据库中搜索HSFs基因, 分析这些基因的数量、序列特征、染色体定位以及进化关系等, 研究结果不仅有助于鉴定黄瓜 HSFs基因家族的功能, 还可进一步为培育黄瓜耐热新品种提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以本实验室选育的黄瓜自交系‘072-5’为研究材料, 催芽后种植于穴盘内, 放置在人工气候室, 白天25℃、晚间18℃。参考杨寅贵等[21]的研究方法,在4叶期进行42℃耐热处理, 分别取处理0 h和2 h的叶片样品。每个取样点设 3个生物学重复。取后立即放液氮速冻, 后贮存于-80℃超低温冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

用RNA Pure Plant提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取黄瓜叶片中的总 RNA, 而后用 DNaseⅠ、RNase-free(fermentas)消除 DNA 的污染, 利用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成 cDNA 第一链。

1.2.2 数据检索

从数据库 http://cucumber.genomics.org.cn/page/ cucumber/index.jsp中下载黄瓜 HSF全基因组数据,从数据库 http://datf.cbi.pku.edu.cn/下载拟南芥 HSF的基因序列。

1.2.3 黄瓜 HSFs基因家族成员的鉴定与保守基序分析

首先使用 DNATOOLS软件对获得的黄瓜全基因组氨基酸序列数据建立数据库, 然后利用Pfam数据库 (http://pfam.sanger. ac.uk/)中的登录号PF00447下载 HSFs基因的隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model, HMM)文件, 获得氨基酸残基的HSFs蛋白的保守结构域, 用 HSFs结构域的氨基酸序列与已建立的黄瓜全基因组氨基酸序列进行 Blast (E-value =0.001)序列比对, 初步筛选出同源氨基酸序列的候选基因, 将这些基因通过Pfam (E-value =1.0) 进行分析, 去除无HSFs保守结构域的基因序列; 再将候选的HSFs基因序列通过MEGA 5.0[22]软件提供的Clustal W 工具进行多序列比对, 去除重复序列。

1.2.4 黄瓜HSFs基因的系统进化分析

转录因子基因家族通常含有高度保守的功能域或有DNA结合功能的保守域。根据预测得到的黄瓜HSFs基因氨基酸保守序列进行聚类分析。利用Clustal X (2.0)[23]软件对黄瓜和拟南芥的HSFs蛋白序列进行多重比对, 参数设为默认值。然后, 通过MEGA 5.0[22]软件进行系统发育树的构建, 采用邻接法(Neighbor-joining method)构建进化树, 自举检测(Bootstrap)次数为1000。

1.2.5 黄瓜HSFs基因结构分析和染色体定位

黄瓜HSFs基因的登录号、所在染色体、基因组位置等信息从黄瓜基因组数据库获得, 蛋白质分子量、等电点等参数用 ProtParam 工具(http://www. expasy. org/tools/protparam)估算。登陆GSDS服务器(Gene Structure Display Server, http://gsds.cbi.pku. edu.cn)获得基因的结构[24]。将每个 HSFs基因与黄瓜全基因组进行Blast搜索, 寻找最匹配的染色体位置, 从而确定每个 HSFs类型基因在染色体上的具体位置。

1.2.6 HSFs转录因子的EST分析

由葫芦科数据库 http://www.icugi.org/cgi-bin/ ICuGI/EST/home.cgi?organism=cucumber下载黄瓜的EST数据。这些EST数据主要来源于不同性型的花和不同时期的果实, 共513 801条。将黄瓜HSFs的核苷酸序列作为靶序列, 对葫芦科网站黄瓜 EST数据库进行BLAST检索, 分析黄瓜HSFs基因在果实、雌花、两性花和雄花的表达情况。参数设置为：同源性大于95%, 长度大于200 bp, E值小于10-10。

1.2.7 黄瓜HSF基因家族成员的表达分析

利用软件Primer Premier 6.0 对黄瓜HSF转录因子基因设计特异引物(表1), 引物的位置不能位于HSF转录因子的保守结构域, 并用软件Oligo 6.0评估调整引物, 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

以 Actin(DQ115883)为内参基因, 正向引物为5′-GGTGGTGAACATGTAACCTC-3′, 反向引物为5′-TTCTGGTGATGGTGTGAGTC-3′。

按照SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒(购自宝生物工程有限公司)操作指导, 在 Bio-Rad 公司的My-IQ2 荧光定量PCR仪上检测基因的表达量。总反应体系为 20 μL：10 μL SYBR premix Ex TaqTM(2×)混合液, 1 μL cDNA, 1 μL上游引物(10 μmol/L), 1 μL下游引物(10 μmol/L), 7 μL ddH2O。反应程序为：95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 60℃复性30 s, 40个循环, 在60℃采集荧光。每个样品设3个技术重复。

基因表达水平的计算参照 Livak和 Schmittgen (2001)的2-ΔΔCT法[25]。

2 结果与分析

2.1 黄瓜HSFs基因的序列特征

经BLASTp同源搜索和Pfam在线工具分析结构域, 共获得21条具典型HSF结构域的序列。基因组全长982～4294 bp, 其中以Csa019047的序列最长,为4294 bp; Csa008853的序列最短, 为982 bp。编码蛋白序列含184～560个氨基酸, Csa019876的编码区(Coding sequences, CDS)全长为555 bp, 编码蛋白序列最短, 为184个氨基酸; 而Csa005086的CDS最长, 为 1683 bp, 编码 560个氨基酸。分子量约为21.2～62.3 kDa, Csa019876 最小, 为 21.2 kDa, Csa005086最大, 为62.29 kDa。等电点变化从4.70～9.10, Csa012865等电点最小, 为4.70, Csa002380等电点最大, 为9.10, 并且发现, 大多数HSFs蛋白的等电点位于5左右, 即呈酸性形式存在(表2)。

2.2 黄瓜HSFs基因序列比对

为了揭示黄瓜 HSFs基因家族成员之间序列保守性特征, 本研究将获得的21条HSFs氨基酸序列进行多序列比对。结果发现, 在所有参与比对的氨基酸中, DBD(DNA binding domain)区域在进化过程中具有高度的保守性(图 1A)。DNA 结合域为转录激活的功能区, 主要负责 HSFs识别热激元件并与其正确结合, 进一步将DBD区域氨基酸残基进行二级结构预测, 除了HSFs Csa012865和Csa019876之外, 发现大多数的HSFs DBD区域均包含3个a螺旋(a1～a3)和4个β(β1～β4)折叠(图1B)。这在其他植物研究中也发现了类似的现象[16～20]。多序列比对发现, 这两个HSFs在β3、β4区域发生氨基酸序列丢失现象。此外, 对其在21个HSFs的 DBD区域编码95个氨基酸残基中, 约 21%(20个)氨基酸残基在进化过程中完全保持一致(PFKDWFLPFKHNFSFRQLNTY) (图1C), 表现出完全保守。

2.3 黄瓜HSFs基因的系统发育关系分析

为了揭示黄瓜 HSFs基因在进化过程中的同源关系, 将黄瓜的21个HSFs氨基酸序列与拟南芥中的22个HSFs氨基酸序列进行聚类分析(图2)。结果显示, 所有的HSFs基因可分为3大分支(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),其中Ⅰ分支又可分为4个亚类(A、B、C、D)。在A类中, 黄瓜的 Csa026480、Csa014653、Csa016743与拟南芥中At3g51910、At3g63350具有较高的同源性而聚集在一起, 其中Csa026480 与Csa014653为旁系同源蛋白, 而Csa000108、Csa011545分别与拟南芥 At3g63350、At2g26150为直系同源蛋白。在B类和C类中, Csa019047、Csa010629、Csa009195、Csa005086、Csa021238分别与At4g17750、At1g67970、At5g54070、At5g03720、At3g24520为直系同源蛋白,而黄瓜Csa006876、Csa021238和拟南芥At3g24520有很高的同源性聚集在一起。在Ⅱ分支中, Csa012865、Csa006414分别与At4g11660、At1g46264为直系同源蛋白, Csa009386、Csa019876分别与Csa011478、Csa002380为旁系同源蛋白。而Csa011800、Csa017341与拟南芥 At4g13980、At4g18880、At5g45710、At4g18870同源性较高聚为第Ⅲ分支。在黄瓜的 21个HSFs蛋白序列中, 共有9对直系同源蛋白, 3对旁系同源蛋白。通过进化关系可以说明, HSFs蛋白序列多样性应该发生在黄瓜和拟南芥分化之前。

表1 黄瓜热激转录因子基因表达分析引物序列及片段大小

表2 黄瓜HSFs基因家族成员的基本特征

2.4 黄瓜HSFs基因的内含子/外显子结构图

本文从黄瓜数据库获得每一个HSF的基因组序列和编码区序列, 借助于在线工具 GSDS(http:// gsds.cbi.pku.edu.cn)绘制其内含子和外显子结构图(图3)。黄瓜HSF基因家族成员的内含子数量很少,为 1～3个, 其中 Csa012865内含子数目最多, 为 3个, Csa000108、Csa006414有2个内含子, 其他18个HSFs基因家族成员内含子数量均为1。然而每一个HSFs基因内含子长度大小差异很大。

2.5 黄瓜HSFs基因的染色体定位

为了明确各基因在不同染色体上的分布, 根据黄瓜基因组数据库中基因位置信息, 对所鉴定的 21个 HSFs基因进行染色体定位。结果发现, 除Csa026480在公布的黄瓜测序结果中未能定位到具体的染色体上(位于 Scaffold_repeat037858), 其余HSFs基因在黄瓜的染色体上呈不均匀分布(图 4)。其中2、3号染色体分布最多, 均为5个, 7号染色体上分布最少, 为1个, 1号染色体上有3个HSFs基因, 4、5、6号染色体上均有2个HSFs基因。

图1 黄瓜HSFs基因的多序列比对A：21个HSFs基因的氨基酸序列进行比对; B：HSFs DBD区域多序列; C：HSFs DBD结构域的logo图。

2.6 HSFs转录因子的EST分析

为了分析黄瓜 HSFs基因的表达模式, 使用BLAST程序搜索葫芦科网站黄瓜的 EST数据库(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi)。在葫芦科基因组的ESTs数据库中, 共具有513,801个黄瓜ESTs序列, 分别来自黄瓜的不同组织类型, 包括果实、雌花、雄花和两性花, 没有叶片、根等营养器官的EST数据。如表3所示, 黄瓜21个HSFs基因中, 12个HSFs在这4个组织中都有表达, 但每一个HSFs检索到的EST数目是变异的(1～5); 其中,与Csa019047和Csa012865对应的ESTs最多, 达到5个, 而Csa016743最少, 仅为1个, 其次Csa000108、Csa005086、Csa009386、Csa011478、Csa017341、Csa021238、Csa026480、Csa014653、Csa002380的 ESTs数量依次为3、3、2、4、2、2、3、3、2。21个HSFs基因中ESTs的分布依次是：果实8个, 雌花 6个, 两性花 5个, 而雄花中均没有检测到 EST的存在。

2.6 HSFs转录因子的表达分析

图2 黄瓜和拟南芥HSFs基因氨基酸序列系统发育关系

图3 黄瓜HSFs基因的内含子/外显子结构图

图4 黄瓜HSFs基因的染色体定位

表 3 基于葫芦科基因组的黄瓜 HSFs转录因子 EST分析

为了检测黄瓜HSF转录因子在叶片中是否表达以及确定对逆境胁迫的反应, 本文利用qRT-PCR分析了21个HSF转录因子的表达情况。结果显示, 除了Csa026480外, 其余的20个HSF转录因子在黄瓜叶片中都具有转录活性; 并且在热激胁迫下, 这些转录因子具有不同的表达模式。大部分的基因表现为上调表达, 且 11个转录因子在热激诱导过程中,他们的表达水平得到显著地提高(＞2倍); 6个HSF转录因子(Csa019047、Csa0112865、Csa009195、 Csa014653、Csa006414、Csa002380)在正常的黄瓜叶片中是微量表达的, 然而, 在热激2小时后, 这些基因的表达得到明显的增强。4个 HSF转录因子(Csa006876、Csa008853、Csa005086、Csa0116743)在正常叶片和热激后表达量无明显差异。此外, 5个HSF转录因子(Csa011800、 Csa011545、Csa010236、Csa009386、Csa021238)在热激诱导过程中, 他们的表达水平表现为下调(＜0.5倍)。

3 讨 论

随着植物基因组研究的深入, 转录因子调控植物基因表达的研究成为现今植物基因功能研究的热点之一。植物热激转录因子家族成员在调节分子和细胞抵御胁迫方面具有关键作用[26,27], 不同植物种类的HSF基因家族成员及大小已得到分析[27], 拟南芥、番茄、水稻, 玉米、苹果、杨树和大豆中分别含有21、27、25、30、25、27、52个HSFs。目前拟南芥是 HSFs家族成员数目最少的植物, 只有 21个, 而包含 52个 HSFs的大豆是最多的, 被子植物的 HSFs家族成员的多样性可能是植物在进化的不同时期发生了基因重复和基因组重复[28]。近年来,黄瓜基因组测序的完成为我们在全基因组水平上分析热激转录因子奠定了基础[29]。本研究基于黄瓜全基因组测序的完成, 对黄瓜全基因组进行BLASP搜索, 共鉴定出21个具有典型HSF结构域的热激转录因子。通过与拟南芥转录因子系统发育关系分析,将其分为 3类(Ⅰ～Ⅲ), 每一类含有的转录因子数目是变异的, 表明HSF转录因子家族成员分布是不均匀的, 他们之间存在着广泛的多样性, 这将为深入研究HSFs的功能奠定基础。

图5 黄瓜HSFs基因在叶片热激条件下的表达模式

热激转录因子 N端的 DBD结构域主要负责HSFs识别热激元件并与其正确结合, 即转录激活的功能区[30], 黄瓜HSFs多序列比对发现, DBD结构域具有高度的保守性, 二级结构由3个α螺旋和4个β折叠组成, 这与Carl等[30]的研究结果一致。此外, 尽管黄瓜和拟南芥具有相同数目的HSFs, 但是从黄瓜与拟南芥HSFs系统发育关系发现, 存在9对直系同源蛋白和3对旁系同源蛋白, 表明黄瓜HSFs基因在黄瓜和拟南芥分化之前就已经构建, 并且在在各自物种进化过程中进行了扩展。这种现象在植物其他基因家族的研究中也得到了广泛的验证[31～33]。前期研究表明, 基因家族成员可以通过串联重复扩展成簇存在于染色体上, 或者通过片段重复分散于不同的染色体上[34]。本研究发现, 黄瓜HSFs以分散形式分布于黄瓜 7条染色体上, 表明他们在进化过程中可能经历片段重复事件。

另外, 为了分析黄瓜HSFs基因的表达情况, 本研究进一步利用葫芦科基因组数据库, 发现共有 12个基因检索到了相应的EST序列, 分别来自于黄瓜果实、雌花、两性花, 而雄花中没有检测到HSFs基因的ESTs序列, 表明这些基因在黄瓜果实、雌花和两性花中得到表达, 可能参与了雌花形成和果实发育。此外, 本研究还运用qRT-PCR方法分析了HSF转录因子在热激胁迫下的表达模式, 大部分的转录因子表达量得到显著上升, 尤其是 Csa019047、Csa0112865、Csa009195、Csa014653、Csa006414和Csa002380的表达量都提高2倍以上, 表明了这些转录因子参与了黄瓜苗期叶片应对热激胁迫的反应,在调节黄瓜对热激的反应过程中具有重要的作用。

总之, 近几年的研究表明, HSFs不仅参与植物热胁迫的调控, 还参与了其他逆境胁迫的调节, 如氧化胁迫[35,36], 但HSFs上游调控的机制尚不清楚。本文基于黄瓜全基因组测序的完成, 鉴定并分析了黄瓜HSFs的基因结构, 进化关系、染色体定位以及表达模式等信息, 为未来解析热激转录因子在黄瓜耐热性机理方面奠定基础, 也为深入了解黄瓜热激转录因子在黄瓜生长发育和其他逆境胁迫中作用提供基因资源和初步依据。

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(责任编委: 李绍武)

Genome-wide identification, sequence characteristic and expression analysis of heat shock factors (HSFs) in cucumber

Xianzhi Chen1,2, Yan Wang1,2, Jianlei Shi1,2, Longjing Zhu1,2, Kelei Wang1,2, Jian Xu1,2

1. Wenzhou Vocation College of Science & Technology, Wenzhou 325006, China;
2. Wenzhou Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Crop Breeding in South Zhejiang, Wenzhou 325006, China

Heat shock factors (HSFs) are ubiquitous in eukaryotes with diversification in structural feature and biological function in plants. Based on the availability of whole cucumber genome sequences, we characterized the cucumber HSFs gene family which contains at least 21 members. Sequence alignments show that all HSFs possess a specific DNA binding domain (DBD). These HSFs genes are unevenly distributed in the seven cucumber chromosomes except for Csa026480 (located on Scaffold_repeat037858). Phylogenetic analysis shows that HSFs in cucumber could be divided into three fami-lies, in which family I included three categories (A, B and C). Phylogenetic tree also reveals nine pairs of orthologous genes and three pairs of paralogous genes, suggesting that HSFs gene family have existed before the separation of cucumber and Arabidopsis thaliana. EST analysis shows that cucumber HSFs may be involved in the development of fruit, female flower and hermaphrodite flower. qRT-PCR analysis demonstrated that these genes exhibit different expression levels in heat stress treatment. These results will provide a foundation for the functions of the HSF gene family.

cucumber; heat shock factors; bioinformatics; heat resistance

2013-10-30;

2013-12-10

温州市科技计划项目(编号：N20090017)和大宗蔬菜产业技术体系经费(编号：CARS-25)资助

陈先知, 硕士, 助理研究员, 研究方向：瓜类蔬菜育种与栽培生理。E-mail: 53186029@qq.com

徐坚, 副研究员, 研究方向：蔬菜栽培生理。E-mail: zwxuj@qq.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0376

时间: 2014-3-3 12:41:40

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.002.html