家蚕两种新的类鹑斑突变体的遗传分析和SSR标记定位

赵巧玲, 王文波, 陈安利, 裘智勇, 夏定国, 钱荷英, 沈兴家

1. 江苏科技大学蚕业研究所, 镇江 212003;

2. 中国农业科学院蚕业研究所, 农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室, 镇江 212018

家蚕两种新的类鹑斑突变体的遗传分析和SSR标记定位

赵巧玲1,2, 王文波1, 陈安利1, 裘智勇1,2, 夏定国1,2, 钱荷英1,2, 沈兴家1,2

1. 江苏科技大学蚕业研究所, 镇江 212003;

2. 中国农业科学院蚕业研究所, 农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室, 镇江 212018

在家蚕品种选育过程中发现了两种斑纹突变体, 与普通斑相比, 其幼虫眼状纹不明显, 而半月纹和星状纹正常, 其间有点和线构成鹑状斑纹, 第6、7腹节背面布有纵向波纹状斑纹, 整体斑纹与鹑斑(quail,q)极其相似, 暂且命名为类鹑斑(quail-like, q-l)。其中一种突变体稚蚕期体色呈褐色, 蚕体发育正常, 蚕茧大小一致, 茧型正常, 称为褐色类鹑斑(brown quail-like, q-lb); 另一种突变体幼虫体色为浅粉紫色, 幼虫食桑量少, 发育缓慢,体质较弱, 体型较小, 茧型偏小, 称为紫色类鹑斑(purple quail-like, q-lp)。遗传分析表明, 两个类鹑斑基因均为隐性基因; 褐色类鹑斑(q-lb)与紫色类鹑斑(q-lp) 为等位基因, 紫色类鹑斑(q-lp)对褐色类鹑斑(q-lb)为隐性。经与形态标记P3(2)、p(2)、Ze(3)、L(4)、re(5)、E(6)、q(7)、I-a(9)、ms(12)、ch(13)、oa(14)、cts(16)、mln(18)、 msn(19)、rb(21)、so(26)测验和SSR分子标记多态性分析, 新发现的两种类鹑斑不同于鹑斑(q), 其基因座位于第8连锁群。

家蚕; 突变体; 类鹑斑; 等位基因; SSR分子标记

家蚕(Bombyx mori)遗传资源丰富, 是研究经典遗传学的极佳材料[1～4]。由于色素在皮肤中的沉积形成繁多的斑纹类型, 其中普通斑被作为幼虫斑纹的正常型(+)。普通斑(+)在第2胸节背面有眼状纹, 第2腹节背面有1对半月纹, 第5腹节背面有1对星状纹。这 3对斑纹表现出多种变异类型, 例如鹑斑(quail, q：7-0.0)、眼纹全黑(bl：15-0.0)、淡眼纹(1es：14-?)、楔形眼纹 (Wes：6-24.3)[5]、心形眼纹(ces：14-50.7)[6]、附加半月纹(ECa：6-21.1)、淡半月纹(Icr：?)、Nc无半月纹(Nc：6-22.5)、无半月纹星状纹 Nl(14-35.2)、多星纹 ms(12-5.5)[7]、新多星纹(19-45.8)等, 这些变异类型被不同学者进行了不同程度的遗传分析或基因定位研究。其中鹑斑常与普通斑形成复合斑纹, 如果与素斑形成复合斑纹, 可见鹑斑中眼状纹不明显, 有半月纹和星状纹, 点和线构成鹑状斑纹, 半月纹和星状纹外周的黑色素似有向后流动状, 是一种隐性突变[2]。最近, 本课题组在家蚕素斑品种0223金黄和932VR中分别发现了酷似鹑斑的突变体, 它们的半月纹和星状纹正常,蚕体背面及侧面有纵向波纹状斑纹分布, 侧面波纹较长, 背面波纹第5腹节后短而密。其中0223金黄中发现突变体稚蚕期体色呈褐色, 称为褐色类鹑斑(Brown quail-like, q-lb); 932VR中发现的突变体幼虫体色为浅紫红色, 称为紫色类鹑斑(Purple quail-like, q-lp)。为了研究这两种突变体的特性, 本文对其进行了遗传分析和初步的基因定位。

1 材料和方法

1.1 突变体与形态标志基因

连续自交 10代褐色类鹑斑(q-lb)、紫色类鹑斑(q-lp)和形态标记基因普通斑P3(2)、素斑p(2)、虎斑Ze(3)、褐圆斑L(4)、红卵re(5)、过剩肢E(6)、鹑斑q(7)、显性赤蚁 I-a(9)、多星纹 ms(12) 、隐性赤蚁ch(13)、油蚕oa(14)、颊尾斑cts(16)、暗化型mln(18)、新多星纹msn(19)、红血rb(21)、煤灰色so(26)及测试品种p50均由中国农业科学院蚕业研究所保存。

1.2 遗传规律分析方法

1.2.1 突变基因的显隐性分析

褐色类鹑斑(q-lb)、紫色类鹑斑(q-lp)分别与正常型素斑(p)杂交和回交, 分别配制正反交F1、F2和BC1,调查各世代斑纹性状表现及其分离比, 分析突变基因的显隐性。

褐色类鹑斑(q-lb)和紫色类鹑斑(q-lp)杂交, 构建正反交F1、F2和BC1, 鉴定两者的关系。

1.2.2 形态标记和分子标记相结合定位突变基因的连锁群

突变基因分别与形态标记基因 P3(2)、p(2)、Ze(3)、L(4)、re(5)、E(6)、q(7)、I-a(9)、ms(12)、ch(13)、oa(14)、cts(16)、mln(18)、msn(19)、rb(21)、so(26)配制 F2群体, 调查突变基因所在连锁群。每个杂交方式调查3蛾区。

采用SSR分子标记方法定位。以正常型p50(+)为亲本1, 以突变型褐色类鹑斑(q-lb)为亲本2, 两者相互杂交, 配制F1; F1再与q-lb回交, 配制[(+×q-lb) ×q-lb]BC1F群体、[q-lb×(+×q-lb)] BC1M群体。参考文献[8], 用 SSRHunter1.3设计 SSR引物, 进行PCR扩增, 在 p50、q-lb及其 F1中筛选多态性标记,并以BC1F作验证。如果某一SSR标记在p50、q-lb中只有1条差异扩增带, 而在F1中表现共显性, 即2条扩增带, 1条同p50, 另一条同q-lb, 那么此标记即为多态性标记。根据家蚕雌完全连锁特点, BC1F群体分离出正常个体和褐色类鹑斑两种个体, 且比例为1∶1。如果某个连锁群的多态性标记在BC1F群体中所有正常个体的 PCR扩增产物的带型同 F1一致、所有突变个体的PCR扩增产物的带型同亲本褐色类鹑斑一致, 那么就可以基本确定此SSR标记与突变基因连锁。BC1M群体也分离出正常个体和褐色类鹑斑两种个体, 且比例也为 1∶1, 进一步用BC1M群体中褐色类鹑斑个体进行检测, ＞50%的个体扩增出与亲本褐色类鹑斑一致的 1条带, 其余个体则扩增出与F1一致的2条带, 说明两个亲本间发生了部分交换, 证明该突变基因在此连锁群上。

2 结果与分析

2.1 两种突变体的性状

褐色类鹑斑是从素斑品种 0223金黄中发现的,与其来源品种相比, 除了斑纹不同外(图 1), 其幼虫的发育经过、发育状况及体质和茧质都一致, 未见异常。紫色类鹑斑是从素斑品种 932VR中发现的,与其来源品种相比, 除了斑纹不同外(图 1), 幼虫发育经过长3～5 d, 蚕体发育不太整齐, 幼虫体型较小,茧型也偏小, 全茧量为0.93 g, 茧层量为0.143 g, 茧层率为15.4%, 而932VR的全茧量为1.34 g, 茧层量为0.266 g, 茧层率为19.86%。

图1 家蚕两个新突变体5龄幼虫斑纹左：紫色类鹑斑; 中：褐色类鹑斑; 右：鹑斑。

2.2 两种突变体斑纹的显隐性

2.2.1 突变体为隐性基因控制

将褐色类鹑斑与正常型素斑进行杂交, 结果显示：无论正反交, F1均表现正常型; F2出现分离现象,有正常型和褐色类鹑斑两种表型, 其分离比为3∶1;以正常型作为回交亲本, 与正反交 F1进行回交, 回交后代均表现为正常型; 以褐色类鹑斑作为回交亲本, 与正反交 F1进行回交, 回交后代表现出正常型和褐色类鹑斑两种表型, 其分离比为1∶1(表1)。由此可见, 褐色类鹑斑由1个隐性基因q-lb控制, 且位于常染色体上。同样, 将紫色类鹑斑(q-lp)与正常型素斑进行杂交, 表现出相同的遗传模式, 由 1个隐性基因q-lp控制(数据略), 表现出非伴性遗传。

2.2.2 褐色类鹑斑基因(q-lb)和紫色类鹑斑基因(q-lp)是等位基因

将褐色类鹑斑与紫色类鹑斑进行杂交和回交,结果无论正交还是反交, F1均表现为褐色类鹑斑; F2出现分离现象, 有褐色类鹑斑和紫色类鹑斑两种表型, 其分离比为 3∶1; 以褐色类鹑斑作为回交亲本,与正反交 F1进行回交, 回交后代均表现为褐色类鹑斑; 以紫色类鹑斑作为回交亲本, 与正反交 F1进行回交, 回交后代表现出褐色类鹑斑和紫色类鹑斑两种表型, 其分离比为1∶1(表2)。由此可见, 褐色类鹑斑与紫色类鹑斑可能是 1对相对性状, 紫色类鹑斑对褐色类鹑斑为隐性性状。

2.3 两种突变体斑纹的连锁分析

2.3.1 用形态标记连锁分析

分别以P3(2)、p(2)、Ze(3)、L(4)、re(5)、E(6)、q(7)、I-a(9)、ms(12)、ch(13)、oa(14)、cts(16)、mln(18)、msn(19)、rb(21)、so(26) 为形态标记, 与类鹑斑杂交(以褐色类鹑斑为例), 配制 F1和 F2群体, 调查分离比。F1均未分离, 且无类鹑斑出现, 说明类鹑斑不在第 2、3、4、5、6、7、9、12、13、14、16、18、19、21、26连锁群。F2出现分离, 除了第7连锁群外, 其余的都出现9∶3∶3∶1分离比, 以第2连锁群普通斑 P3(2)检测为例, 结果见表 3。将褐色类鹑斑与普通斑进行杂交, 无论正反交F1均表现普通斑; F2出现分离现象, 有普通斑、素斑、褐色类鹑斑与普通斑叠加、褐色类鹑斑4种表型, 其分离比为9∶3∶3∶1; 以普通斑作为回交亲本, 与正反交F1进行回交, 回交后代均表现为普通斑; 以褐色类鹑斑作为回交亲本, 与正反交 F1进行回交, 回交后代表现出普通斑、素斑、褐色类鹑斑与普通斑叠加、褐色类鹑斑4种表型, 其分离比为1∶1∶1∶1。由此可见, 从素斑品种0223金黄中突变的褐色类鹑斑以素斑为基础斑纹, 基因型为pp q-lbq-lb。

表1 褐色类鹑斑(q-lbq-lb)与正常型素斑(++)杂交各世代的性状分离

表2 褐色类鹑斑和紫色类鹑斑杂交各世代性状分离

2.3.2 用SSR分子标记连锁分析

在第7、8、10、11、15、17、20、22、23、24、25、27、28连锁群设计SSR引物, 在p50、褐色类鹑斑及其F1间筛选多态性标记。在p50、褐色类鹑斑均扩增出 1条带, 但两者间具有多态性, 表现出分子量差异, 在 F1中扩增出 2条带, 共显性两个亲本的带型。进一步以BC1F群体中10个正常个体和10个褐色类鹑斑个体进行验证, 只有第8连锁群的多态性标记 S0805(引物 chr08-5F：AATAGACCCAAGACAAGG; chr08-5R：TTACTACTACGAACCGAAA)在BC1F群体中所有正常个体的PCR扩增产物的带型一致, 同 F1表型为 2条带, 所有突变个体的PCR扩增产物的带型一致, 同亲本褐色类鹑斑为1条带(图2A)。进一步在第8连锁群筛选到多态性SSR标记W0808(引物chr08-8F： CGCTCGCATAATGTGATA; chr08-8R：CGAAGGGGCCATATTTAA),其BC1F群体验证结果与S0805相同(图2B)。利用BC1M群体中45个褐色类鹑斑个体进行检测, 有44个个体扩增出与亲本褐色类鹑斑一致的1条带, 1个个体则扩增出与F1一致的2条带, 说明两个亲本间发生了部分交换(图3)。其他连锁群的多态性标记在BC1F群体中验证没有呈现规律性。由此确定第8连锁群的多态性SSR标记与突变基因连锁, 即褐色类鹑斑基因位于第8连锁群。

表3 褐色类鹑斑与普通斑杂交各世代性状分离

图2 SSR标记S0805(A)、W0808(B)在褐色类鹑斑BC1F群体中的扩增电泳图谱1：亲本P50(P1); 2：F1代个体; 3：亲本褐色类鹑斑(P2); 4～13：BC1F群体中正常型个体; 14～23：BC1F群体中突变型个体。

图3 W0808标记在褐色类鹑斑BC1M群体中的扩增电泳图谱1：亲本P50(P1); 2：F1代个体; 3：亲本褐色类鹑斑(P2); 4～16：BC1M群体中突变型个体。

2.3.3 褐色类鹑斑(q-lb)与鹑斑(q)的连锁分析

鹑斑常常以普通斑或素斑为基础斑纹, 为了排除普通斑的干扰, 选择以素斑为基础斑纹的鹑斑(quail, q：7-0.0)进行实验。将类鹑斑与鹑斑进行杂交, 由于突变体斑纹与鹑斑极其类似, 肉眼无法分辨, F2出现素斑与(类)鹑斑(鹑斑或类鹑斑之和)的分离比为9∶7, 经χ2测验, P＞0.05(表4)。此现象类似于非等位基因间的互作关系, 类鹑斑与鹑斑有“互补关系” (Complementary genes)。

在第 7连锁群筛选到多态性 SSR标记 S39495 (引物 chr07-39495F：GGCATCCGATTGACTTGA; chr07-39495R：TGGGTAATGGCAACAACG), 在BC1F群体中用10个正常个体和10个褐色类鹑斑验证, 没有呈现规律性(图4)。说明褐色类鹑斑与鹑斑不连锁。

综上所述, 可以看出尽管类鹑斑与鹑斑表型相似, 但为非等位基因, 也不是拟等位基因。类鹑斑是一个新基因。

3 讨 论

家蚕幼虫斑纹易于识别, 是遗传学研究的极好材料, 其类型繁多, 有的是多种斑纹组合而成的复合斑纹, 蒋同庆[2]将第二连锁群的 p等位基因群作为基础斑纹, 将Ze、L和q等作为附加斑纹。这种方法使复杂的斑纹组合分类更清晰, 识别更容易。类鹑斑也可以理解为复合斑纹, 即在素斑基础上附加了类鹑斑(在第2腹节背面有1对半月纹、在第5腹节背面有 1对星状纹以及在侧面和背面有向后流动的短线波纹)。

褐色类鹑斑与紫色类鹑斑是 1对相对性状, 受等位基因控制, 紫色类鹑斑对褐色类鹑斑为隐性性状。它们不仅主体斑纹相似, 而且其杂交后代分离比例符合孟德尔1对相对性状分离规律。但是它们在生长发育过程中的表型有一些有差异, 紫色类鹑斑相对于褐色类鹑斑, 蚕体肤色为浅紫红色, 稚蚕及蜕皮后特别明显, 食桑量少, 发育缓慢且不整齐,体质较弱, 体型较小, 大小不一, 蚕茧大小不一致,茧型偏小。家蚕中常常有同种斑纹类型, 也因温湿度等环境条件的影响, 斑纹颜色还有浓淡差别。斑纹深浅差异还与蚕儿的发育阶段有关, 一般是同一龄期中起蚕浓而盛食期淡。同种斑纹内浓淡型间相互杂交, 整体上均表现为等位基因的遗传模式[9]。

通过形态标记和分子标记相结合连锁分析, 类鹑斑被定位于第8连锁群, 是不同于鹑斑 q的新基因。类鹑斑与鹑斑是非等位基因, 它们杂交的F2出现非鹑斑(素斑112头)与鹑斑(鹑斑或类鹑斑共86头)的分离比为9∶7。此现象类似与非等位基因间的互作关系, 类鹑斑与鹑斑有“互补关系”, 即两种非等位显性基因同时存在时, 才出现某一性状(非鹑斑),当只有一种基因是显性, 或两对基因都是隐性时,则表现为另一种性状(鹑斑)。

鹑斑的表皮为浅紫红色, 含有棕色颗粒和白黄色颗粒, 棕色颗粒中包含眼色素, 而白黄色颗粒包含有碟啶类和尿酸。在整个发育过程中鸟苷三磷酸环化水解酶 GTPCH的活性和碟啶的含量都比正常个体高, 而且四氢生物碟呤BH4含量的变化几乎与GTPCH的活性变化一致。说明碟啶的生物合成与黑色素和眼色素的形成密切相关[10～12]。紫色类鹑斑不仅与鹑斑斑纹相似, 其表皮同样为浅紫红色, 推测有同样的色素沉积, 但与鹑斑的控制基因却不同,它们的色素代谢途径是不是也有所不同呢？这是值得深入研究的课题, 也是我们发现并分析两个突变体的意义所在。今后, 我们将进一步进行类鹑斑基因的精细定位及功能研究。

表4 褐色类鹑斑(q-lbq-lb)与鹑斑(q q)杂交各世代性状分离

图4 S39495在褐色类鹑斑BC1F群体中的扩增电泳图谱1：亲本P50(P1); 2：F1代个体; 3：亲本褐色类鹑斑(P2); 4～13：BC1F群体中正常型个体; 14～23：BC1F群体中突变型个体。

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(责任编委: 李绍武)

Genetic analysis and gene mapping of two novel quail-like mutants from the silkworm (Bombyx mori)

Qiaoling Zhao1,2, Wenbo Wang1, Anli Chen1, Zhiyong Qiu1,2, Dingguo Xia1,2, Heying Qian1,2, Xingjia Shen1,2

1. The Sericultural Research Institute of Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212003, China;
2. Key Laboratory of Silkworm and Mulberry Genetic Improvement, Ministry of Agriculture; Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China

Two novel body marking mutants were discovered during silkworm (Bombyx mori) breeding. The mutants have no obvious eye-spots compared with normal marking (+) individuals, but their star spots and semilunar markings on dorsal sides are normal, and there are dots and lines with longitudinal wave markings on dorsal sides of the 6thto 7thabdominal segments which consist quail markings in between star spots and semilunar markings. The whole body markings are very similar to that of quail mutant (q); thus these mutants are named as quail-like mutants (q-l). Young larvae of one mutant are in brown color, and develop normally. Their cocoons are regular and uniform in size. Thus, this mutant is designated asbrown quail-like (q-lb). Another mutant’s larvae are in light purple skin; thus this mutant is named as purple quail-like (q-lp). They take little amount of mulberry leaves, and are weak and develop slowly and unevenly. Their larval bodies and cocoons are small. Genetic analysis revealed that both q-lband q-lpwere recessive genes, and they were allelic, with q-lbrecessive to q-lp. These genes are different from quail mutant (q) and located on the chromosome 8 after tested by the morphological markers, P3(2), p(2), Ze(3), L(4), re(5), E(6), q(7), I-a(9), ms(12), ch(13), oa(14), cts(16), mln(18), msn(19), rb(21) and so(26) and SSR markers.

Bombyx mori; mutant; quail-like body marking (q-l); allele; SSR

2013-11-12;

2013-12-17

国家自然科学基金项目(编号：31372378), 江苏省科技支撑计划(农业)项目(编号：BE2011327-2)和“十二五”国家支撑计划项目(编号：2011BAD33B04)资助

赵巧玲, 博士, 研究员, 研究方向：家蚕遗传育种和分子生物学。Tel: 0511-85616707, E-mail: qlzhao302@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0369

时间: 2014-3-27 14:33:47

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140327.1433.004.html