PAX3基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义△

张华 李家大 罗浑金 陈红胜 梅凌云 贺楚峰 冯永

PAX3(Pair Box 3，配对盒基因)基因位于染色体2q35-2q37，cDNA序列全长1 440 bp，其编码的PAX3蛋白是配对盒转录因子PAX家族成员之一。PAX3蛋白在脊椎动物高度保守，是神经嵴(neural crest，NC)发育的主要调控因子之一[1]。PAX3基因突变影响NC发育，可导致Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome，WS)[2]。WS是最常见的遗传性综合征型聋，又称听力-色素综合征，属NC病之一，是由于NC发育异常而导致的一组临床症候群，主要以NC源性细胞黑素细胞分化缺陷致发育异常导致的色素分布异常和耳聋为特征[3]。根据WS临床特征及不同的伴随表型将WS分为4型(WS1～4)[2]，感音神经性聋和虹膜异色是WS最常见的特征性表型，PAX3基因突变可导致WS1和WS3。

前期研究发现2个致WS1的新发PAX3基因突变H80D(c.238C>G)和H186fs(c.556delC)[4]，本研究通过构建人PAX3基因及其突变H80D和H186fs表达质粒并观察其在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)的表达和定位，为进一步研究国人PAX3基因突变致WS发病的分子机制奠定一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞 NIH3T3细胞用于构建瞬时表达细胞模型，由中南大学医学遗传学国家重点实验室提供。

1.1.2主要试剂 野生型PAX3基因(GenBank accession no，NM181457.3)真核细胞表达质粒pECE-PAX3由法国Bondurand Nadege教授惠赠；pcDNA3.0-3×HA购自Clontech公司；NucleoSpin Plasmid kit购自德国Macherey-Nagel公司；Lipfectamine 2000购自美国Invitrogen公司；DMEM、FBS、Pen Strep、Opti-MEM、胰酶购自美国Gibco公司；Protease inhibitor cocktail、单克隆鼠抗HA抗体、TWEEN-20、辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗鼠IgG、PMSF、ONPG、DAPI、Protein-G-Agargose、Tween-20、NP-40购自美国Sigma公司；Cy2标记的山羊抗鼠二抗购自美国Jackson公司；PVDF膜购自Millipore公司；fluoromount-G购自Southern Biotech公司；Triton X-100购自Bio Basic公司；Phusion超保真DNA聚合酶、DpnⅠ酶、NotⅠ酶、EcoRⅠ酶购自New England Biolabs公司；T4 DNA连接酶购自TakaRa公司。

1.1.3主要仪器 Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)、Leica DMI 3000B荧光倒置式生物显微镜(德国Leica公司)、CO2细胞培养箱(Thermo公司)、NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo公司)、Tanon-1600全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)、37 ℃恒温室均由中南大学医学遗传学国家重点实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1PAX3基因重组真核细胞表达质粒的构建

1.2.1.1野生型PAX3基因重组真核细胞表达质粒pcDNA3.0-PAX3-HA的构建 以获赠的真核细胞表达质粒pECE-PAX3为模板，PCR扩增目的片段PAX3。根据pcDNA3.0-HA的质粒图、序列以及多克隆酶切位点，设计PCR扩增引物，上游引物：5′-CGATAGAATTCATGACCACGC TGGCCGGCGC-3′，下游引物：5′-CGATACAGCGGCCGCCTAAAAAGTCCAAGG C-3′，斜体为保护碱基，下划线为分别为EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系25 μl(模板质粒1 μl，5×HF Buffer 5 μl，dNTP 0.5 μl，Phusion超保真DNA聚合酶 0.5 μl，引物各1 μl，去离子水16 μl)，反应条件：98 ℃变性30 s后进行循环，98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环25次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物纯化回收后与pcDNA3.0-HA分别由EcoRⅠ酶和NotⅠ酶双酶切，反应体系50 μl(纯化产物PAX3或pcDNA3.0-HA 10 μl，EcoRⅠ 0.5 μl，NotⅠ 0.5 μl，10×Buffer 4和10×BSA各5 μl，去离子水29 μl)，反应条件：37 ℃，4～8 h。PAX3双酶切产物目的片段和pcDNA3.0-HA双酶切载体片段在1%琼脂糖凝胶中电泳跑胶验证，切胶回收、纯化后连接，连接体系10 μl(目的片段PAX3 4 μl，载体片段pcDNA3.0-HA 2 μl，T4DNA连接酶1 μl，10×T4DNA连接酶Buffer 1 μl，去离子水2 μl)，反应条件：16 ℃，连接过夜。连接产物转化、涂板、筛选与扩增后，挑选鉴定克隆。双酶切连接产物经电泳初步鉴定正确后DNA测序进一步鉴定(武汉华大基因公司测序)。

1.2.1.2突变型PAX3基因重组真核细胞表达质粒pcDNA3.0-H80D-HA和pcDNA3.0-H186fs-HA的构建 以pcDNA3.0-PAX3-HA为模板PCR扩增H80D、H186fs突变型真核细胞表达质粒，利用在线软件The QuikChange®Primer Design Program(https://www.genomics.agilent.com)在PAX3基因(GenBank accession no，NM181457.3)编码区突变位点两侧分别设计两对突变引物，H80D突变位点引物序列：上游5′-TGCGCGTGTCCGACGGCTGCGTC-3′；下游5′-GACGCAGCCGTCGGACACGCGCA-3′。H186fs突变位点引物序列：上游5′-AGGAA AGCGAGAAGAAGGCCAAAACAGCATCGACG-3′；下游：5′-CGTCGATGCTGTTTTGGCCTTCTTCTCGCTTTCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系25 μl(pcDNA3.0-PAX3-HA 5 μl，5×HF Buffer 5 μl，dNTP 0.5 μl，Phusion超保真DNA聚合酶 0.5 μl，突变引物各1 μl，去离子水12 μl)，同时将不含引物的PCR反应体系设为阴性对照。反应条件：98 ℃变性30 s后进行循环，98 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共循环25次，4 ℃保存。加入1 μl DpnⅠ内切酶消化，37 ℃，过夜。酶切产物转化、涂板、筛选与扩增后，挑选鉴定克隆。电泳初步鉴定正确后DNA测序进一步鉴定(武汉华大基因公司测序)。上述构建质粒DNA测序鉴定正确后NucleSpin Plasmid Kit试剂盒抽提质粒，分光光度计测质粒浓度，-20 ℃保存。

1.2.2细胞培养、接种和转染 NIH3T3细胞用DMEM+10%FBS+1% Pen Strep培养于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中。转染前1天用胰酶消化细胞后均匀接种于24孔板或12孔板中，使每孔细胞密度达30%～40%。第二天细胞生长密度达50%～60%时进行脂质体法转染，每转染1 μg DNA需3 μl Lipfectamine 2000，加入Opti-MEM，6～8 h后吸尽加入新鲜DMEM继续培养。

1.2.3PAX3的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)序列预测 应用NLS预测软件预测PAX3的NLS序列(http://cubic.bioc.columbia.edu/predict NLS/)。

1.2.4Western blot检测野生型、突变型PAX3蛋白在NIH3T3细胞中的外源性表达 野生型PAX3及突变型H80D、H186fs质粒分别单独转染NIH3T3细胞48 h后，吸尽12孔板中的DMEM。1×PBS清洗后每孔加入2×SDS上样缓冲液80 μl(含Protease inhibitor cocktail 0.8μl和0.1 M PMSF 0.8 μl)，冰上裂解10 min，将贴壁细胞刮下后分别移至清洁EP管中。超声破碎后，95 ℃煮沸变性10 min，冷却至室温。13 000 rpm，离心1 min，将上清移至新EP管内，取10～15 μl上样在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳跑胶(分离胶12%，浓缩胶5%)。转膜后封闭、洗涤，加入一抗鼠抗HA单克隆抗体(1:2 000)，4 ℃过夜。洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠二抗(1:10 000)，室温1 h。ECL试剂盒显色后曝光、显影、成像。

1.2.5细胞免疫荧光检测野生型、突变型PAX3蛋白在NIH3T3细胞中的定位表达 转染前1 d将NIH3T3细胞用胰酶消化后接种于加有灭菌圆形盖玻片的24孔板中，使每孔细胞密度达10%～20%，野生型PAX3及突变型H80D、H186fs质粒分别单独转染48 h后，吸尽24孔板中的DMEM，1×PBS洗1次。每孔加入4%多聚甲醛室温固定30 min后吸尽，1×PBS洗涤2次；每孔加入0.2% PBST(250 ml 1×PBS +500 μl Triton X-100 1×PBS)室温透化30～60 min，吸尽；每孔加入200 μl PBSB(牛血清白蛋白+山羊血清+0.2% PBST)封闭60 min，吸尽。每孔加入单克隆鼠抗HA抗体(1:400)于4 ℃过夜。0.2%PBST洗3次后加入Cy2标记的山羊抗鼠二抗(1:300)室温避光孵育60 min。0.2%PBST洗3次后加入DAPI核染色2～3 min，吸尽后1×PBS洗涤3次；fluoromount G封片后激光共聚焦显微镜断层扫描后照相保存。

2 结果

2.1PAX3的NLS序列预测结果 PAX3预测软件预测PAX3的NLS序列发现PAX3有两个NLS分别位于HD域的两端。一个NLS序列是215LKRKQRR221，位于HD域的N端，另一个NLS序列是270RRARWRKQ277，位于HD域的C端(图1)。

2.2PAX3基因重组真核细胞表达质粒pcDNA3.0-PAX3-HA的构建 由于获赠质粒pECE-PAX3没有蛋白标签，根据实验设计和后续实验需要对其进行改造与重组，以获得具有蛋白标签的目的载体。利用分子克隆技术选择EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点将PAX3 cDNA从获赠质粒中酶切后克隆到载体pcDNA3.0-HA上从而构建了目的重组质粒pcDNA3.0-PAX3-HA，其中含有PAX3基因的全长cDNA 1.44 kb。在pcDNA3.0-PAX3-HA中的PAX3 cDNA片段的5′端含有HA标签，这样它编码的蛋白的N端就带有了HA标签(YPYDVPDYA)，可以被特异性抗HA抗体识别。

2.2.1由pECE-PAX3扩增PAX3的电泳鉴定结果 PAX3基因cDNA全长1.4 kb，PCR扩增pECE-PAX3产物电泳出现1.44 kb大小条带(图2a)，与目的条带PAX3大小符合。

2.2.2PAX3与pcDNA3.0-HA双酶切电泳鉴定结果 pcDNA3.0-HA全长5.4 kb，与纯化回收的PCR扩增PAX3产物双酶切后电泳，分别获得了5.4 kb片段和1.44 kb片段(图2b)，与目的条带pcDNA3.0-HA和PAX3大小符合。

2.2.3PAX3与pcDNA3.0-HA双酶切产物连接后电泳鉴定结果 pcDNA3.0-PAX3-HA连接产物转化涂板后挑选6个单克隆进行双酶切电泳鉴定，结果如图2c所示，1～6道连接产物均被EcoRⅠ/ NotⅠ切开，均获得两条5.4 kb和1.44 kb大小片段，分别与目的条带pcDNA3.0-HA和PAX3大小符合。重组质粒pcDNA3.0-PAX3-HA中插入的目的基因PAX3 cDNA序列与GenBank中的相应登录序列比对正确，说明PAX3基因正确的插入到了质粒pcDNA3.0-HA的EcoRⅠ和NotⅠ之间。

2.3PAX3基因突变真核细胞表达质粒pcDNA3.0-80D-HA和pcDNA3.0-186fs-HA的构建 重组质粒pcDNA3.0-PAX3-HA中插入的目的基因PAX3 cDNA序列与GenBank中的相应登录序列比对正确后，以目的重组质粒pcDNA3.0-PAX3-HA为模板构建H80D和H186fs突变型真核细胞表达载体，双酶切初步鉴定正确后经DNA测序鉴定突变位点的核苷酸序列均正确(图3、4)，说明pcDNA3.0-80D-HA和pcDNA3.0-186fs-HA构建成功。

图1 PAX3蛋白NLS序列预测结果

图2 重组真核细胞表达质粒pcDNA3.0-PAX3-HA的鉴定

a PAX3扩增 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M：1kb DNA ladder marker， 1：PAX3产物；b PAX3和pcDNA3.0-HA的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，M：1kb DNA ladder marker，1：PAX3 2：pcDNA3.0-HA；c pcDNA3.0-PAX3-HA连接产物双酶切电泳鉴定，M：1kb DNA ladder marker，1～6：pcDNA3.0-PAX3-HA双酶切产物

图3 突变型H80D与野生型PAX3的DNA测序峰图 a：野生型PAX3 b：突变型H80D

图4 突变型H186fs与野生型PAX3的DNA测序峰图 a：野生型PAX3 b：突变型H186fs

2.4野生型及突变型PAX3蛋白在NIH3T3细胞中的外源性表达 H80D(c.238C>G)是一错义突变，突变的PAX3基因的238位上的碱基C变为碱基G，产生的突变蛋白的80位的组氨酸变成了天冬氨酸，但含有的氨基酸与野生PAX3蛋白相同，分子量仍为53 kDa。H186fs(c.556delC)是由于PAX3基因的556位缺失了碱基C，导致其后的核苷酸移位，编码的蛋白在192位氨基酸出现终止密码子，产生含有191个氨基酸的截断蛋白，最后5个氨基酸由移码的核苷酸编码，分子量大小约21 kDa(图5a)。

构建成功的真核细胞表达载体中的目的基因可以在细胞中表达相应的蛋白，为了研究突变蛋白表达是否正常，同时进一步验证构建的突变质粒是否正确，利用Western blot对其在NIH3T3细胞中的外源性表达进行检测，结果野生PAX3蛋白和突变H80D、H186fs蛋白出现目的条带，大小正确(图5b)。

图5 Western blot检测野生型、突变型PAX3蛋白在293T细胞中的表达

a：野生型、突变型PAX3蛋白结构示意图，X后数字表示框码移位的氨基酸的数量；b：野生型、突变型PAX3蛋白的表达

2.5野生型/突变型PAX3蛋白在NIH3T3细胞中的定位表达 为进一步了解并研究2个PAX3突变蛋白的亚细胞定位，利用细胞免疫荧光对他们在NIH3T3细胞中的定位表达进行观察。结果发现H80D突变蛋白和野生PAX3蛋白一样只在细胞核中分布，而H186fs突变蛋白则出现异常亚细胞定位，在细胞核与细胞质中均有分布(图6)。

图6 野生型、突变型PAX3蛋白在NIH3T3细胞中定位(×1 200)

PAX3野生蛋白和H80D突变蛋白仅在细胞核内分布，H186fs突变蛋白在细胞核与细胞质内均有分布。绿色：cy2染色，示野生PAX3蛋白(a)，H80D突变蛋白(d)，H186fs突变蛋白(g)；蓝色：DAPI染色，示细胞核(b，e，h)；绿色和蓝色叠加后的图像(c，f，i)；WT：野生型(wild type)

3 讨论

PAX3基因编码的PAX3蛋白由479个氨基酸组成，主要含有配对盒结构域(paired box domain，PD)、同源结构域(homeodomain，HD)、高度保守的锌肽序列和富含丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸的转录激活域(transcriptional activation，TA)[2]，其分子量大小约53 kD。PAX3最早于NC迁徙前在背神经管表达，后随神经管的发育逐渐在中枢神经系统、关节、骨骼肌以及NC源性组织如周围神经系统、心肌间质、平滑肌、胸腺、肾上腺髓质、皮肤毛发和内耳的黑素细胞中广泛表达。PAX3通过调节NC发育而参与胚胎生长发育的调控，在骨骼肌及黑色素的形成过程中发挥重要作用[1，5]。在黑素细胞的发育中，PAX3主要通过直接或与其它转录因子协同作用激活或抑制小眼球畸形相关转录因子(microphthalmiaassciated transcription factor,MITF)、多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase,DCT)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TRP1)的表达，参与调控黑素细胞的生长、发育与分化，既能促进也能抑制黑色素合成[1，6]。MITF、TRP1和DCT是黑素细胞发育和黑色素合成中的关键调控因子。动物实验研究显示黑素细胞发育不良会引起血管纹中黑素细胞源性的中间细胞缺乏进而造成Corti器退化变性，最终导致感音神经性聋[7]。PAX3基因突变通过影响NC发育尤其是NC源性黑素细胞发育导致WS。

以转染为基础的体外实验是研究突变对基因功能影响最常用的实验方法[6,8,9]，需要利用分子克隆技术将目的基因克隆到载体构建真核细胞表达载体后导入细胞。本实验在以野生型质粒为模板构建突变质粒时应用Phusion超保真DNA聚合酶较高效率地通过PCR将突变的cDNA片段扩增出来。利用成功构建的野生型和突变型PAX3真核细胞重组表达质粒通过瞬时转染NIH3T3细胞进行蛋白表达检测，结果显示野生PAX3、突变H80D和H186fs蛋白在NIH3T3细胞均正确表达，进一步验证了构建的突变表达质粒的正确性，也为下一步亚细胞定位实验奠定了基础。尽管错义突变H80D未影响氨基酸合成数量，其翻译成的突变蛋白与野生蛋白具有相同的多肽链，但80位氨基酸的改变可能使突变蛋白多肽链在构象、极性等方面与野生蛋白出现差异而导致其蛋白功能的异常，有待进一步研究。

PAX3蛋白是转录因子，属于核蛋白，仅在细胞核中分布并行使其正常功能，在其氨基酸序列上拥有特异的核定位信号NLS，可以被相应的核转运蛋白识别后通过细胞核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)进入到细胞核，然后和靶基因的启动子结合启动转录。因此，正常的细胞分布是PAX3行使其正常的生理功能的前提条件，异常的细胞分布必然导致其功能的异常。PAX3蛋白的NLS序列还没有文献报道，本研究利用NLS预测软件预测了PAX3的NLS序列(http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/)，发现PAX3有两个NLS分别位于HD域的两端。一个NLS序列是215LKRKQRR221，位于HD域的N端，另一个NLS序列是270RRARWR KQ277，位于HD域的C端。HD是PAX3蛋白与DNA结合以及与其他蛋白相互作用的重要功能域，由第220～277位共58个氨基酸组成。H80D突变蛋白的HD域及两个NLS序列完整，可以被转运蛋白识别并被转运通过NPC进入细胞核，所以其亚细胞定位与野生PAX3一样。而H186fs突变蛋白失去了HD域和两个NLS序列，成为大小约21 kDa的截断蛋白，可以通过被动扩散经NPC进入细胞核内，出现异常的亚细胞定位，在细胞核和细胞质内均有分布，提示H186fs突变蛋白功能异常。

PAX3基因突变可导致PAX3蛋白功能的异常进而影响黑素细胞发育，本研究初步显示了基因突变对PAX3蛋白在细胞中分布的影响。但PAX3基因突变体H80D和H186fs如何影响PAX3对靶基因的调控导致国人WS的发病机制尚需进一步研究，本研究为其奠定了实验基础。

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