壳聚糖絮凝法脱除大枣多糖蛋白质的研究

杨 辉， 米 佳， 罗建华

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.怀来县贵族庄园葡萄酒业有限公司，河北 怀来 075400)

0 引言

大枣为鼠李科植物枣的干燥成熟果实，是我国的主要特产果实.现代药理学研究表明，大枣中含有丰富的糖类、脂类、蛋白质等物质，具有十分丰富的药用价值[1-3].

大枣多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化等作用[4-7]，其多样的药理作用使得大枣多糖有着广泛的应用前景.然而，目前提取的大枣粗多糖中多含有一定量的蛋白质，这在一定程度上影响了大枣多糖的综合应用.而且传统的脱蛋白方法，如sevag法、三氯乙酸法等，都引入大量有机溶剂，不仅操作复杂并且废液处理困难[8-11].因此，寻找一种合适的脱蛋白方法对于大枣多糖的开发应用是十分必要的.

壳聚糖是一类天然的阳离子型高分子絮凝剂，其作为甲壳素的脱乙酰化产物，具有良好的生物相容性、无毒性、可降解特性等.壳聚糖在溶液中为带正电荷的聚电解质，可利用电荷和大分子间的架桥作用，有效除去多糖中的蛋白质、色素等杂质[12-14].本实验利用壳聚糖的絮凝作用，去除大枣多糖中的蛋白质，优化脱蛋白工艺，为大枣多糖的综合利用提供了参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大枣(市售)，壳聚糖(济南海得贝生物公司),葡萄糖(成都金山化学试剂有限公司),浓硫酸(北京化工厂),苯酚(天津市红岩化学试剂厂),考马斯亮蓝G-250(天津市科密欧化学试剂开发中心),牛血清白蛋白(北京鼎国生物技术有限公司),磷酸(天津市天士力化学试剂有限公司),95%乙醇(天津市天士力化学试剂有限公司).

1.2 仪器与设备

电子天平(赛多利斯仪器有限公司),722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),电热恒温水浴锅(DK-S22型，上海精宏实验设备有限公司)，旋转蒸发仪(RE52CS-1型，上海亚荣仪器厂)，高速台式离心机(GT10-1型，北京时代北利离心机有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 大枣多糖的提取

取一定质量的大枣，采用水提醇沉法，以料液比为1∶6于90 ℃水浴破皮提取2 h，离心分离得大枣粗多糖提取液.所得提取液经浓缩、醇沉、离心、干燥后得大枣粗多糖.

1.3.2 壳聚糖溶液的配置

精确称取1.000 0 g壳聚糖溶于100 mL的1%(V/V)醋酸溶液中，配成1%的壳聚糖溶液，充分搅拌均匀，溶胀24 h备用.

1.3.3 壳聚糖絮凝法脱蛋白单因素实验

将提取的大枣粗多糖按一定的比例以水复溶，依据单因素实验方案，于大枣粗多糖水溶液中加入一定量的壳聚糖溶液，控制脱蛋白温度、酸度和时间，进行单因素实验.离心过滤，获取纯化后大枣多糖复溶液，测定其蛋白质含量和多糖含量.

选取四个因素进行单因素实验，实验方案为：壳聚糖絮凝剂添加量选取0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、3.00 mg/mL、5.00 mg/mL和7.00 mg/mL；絮凝温度设定30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃；大枣复溶液pH选取2、4、6、8和10；絮凝时间选定10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min和100 min.以大枣多糖蛋白质脱除率和多糖损失率为考量指标.

1.3.4 壳聚糖絮凝法脱蛋白正交试验

根据单因素实验结果，以絮凝剂添加量A、絮凝温度B、絮凝时间C等为因素，每个因素取3水平，按L9(34)正交试验表进行试验，试验因素及水平见表1所示.

表1 壳聚糖脱除大枣多糖蛋白质试验因素及水平

1.4 分析方法

1.4.1 多糖含量的测定方法[15]

多糖含量的测定，采用苯酚-硫酸法.以葡萄糖为标准品，在490 nm处测定其吸光值，得到标准曲线：y=7.501 9x-0.020 7，R2=0.997 5

多糖损失率=(C1-C2)/C1×100

(1)

式中：C1—絮凝前大枣多糖含量；C2—絮凝后大枣多糖含量.

1.4.2 蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定方法，采用考马斯亮蓝G-250法.以牛血清白蛋白为标准品，在595 nm处测定其吸光值，标准曲线y=6.665 7x+0.009 5，R2=0.995 4.

蛋白质脱除率=(M1-M2)/M1×100

(2)

式中：M1—絮凝前蛋白质含量；M2—絮凝后蛋白质含量.

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖添加量对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响

图1为壳聚糖添加量对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响.结果表明，当壳聚糖从0.5 mg/mL增加到1 mg/mL时，蛋白脱除率有较大增长，同时大枣多糖的损失率也随之增加；当在1～5 mg/mL范围内时，大枣多糖损失率的增长率大于蛋白脱除率，蛋白脱除率变化较小，当在5 mg/mL时大枣多糖损失率超过蛋白脱除率.这可能是因为当壳聚糖添加量较小时，其优先与易于结合的蛋白质作用，当壳聚糖用量增加时其与蛋白质作用达到饱和，这时过量壳聚糖与多糖作用而引起多糖较大损失.因此，综合考虑蛋白脱除率和多糖损失率，选择添加3 mg/mL的絮凝剂较为适宜.

图1 絮凝剂添加量对大枣多糖蛋白脱除率 和多糖损失率的影响

2.2 絮凝温度对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响

图2为絮凝温度对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响.由图2看出，壳聚糖的絮凝温度不宜过高.从生产节能角度分析，30 ℃较好;从絮凝速度分析，40 ℃～50 ℃絮凝温度可以加强体系的热运动，从而增大了壳聚糖絮凝剂与蛋白质的碰撞几率，缩短了絮凝时间，提高了絮凝效率.

2.3 pH对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响

图3为pH对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响.结果表明，酸性环境有利于壳聚糖絮凝蛋白质，蛋白脱除适宜pH为4，在此条件下，多糖损失较小；pH>4条件下，蛋白质脱除率直线下降，而多糖损失的影响呈现先增加后减小的趋势；在pH为6时，多糖损失达到最大.这是因为在酸性环境中，壳聚糖分子可以较好地伸展和质子化，有利于与蛋白质发生电中和；而在碱性环境中，则分子舒展不开，质子化能力减弱，对蛋白质和多糖絮凝效果较差.由于大枣多糖复溶液的pH正好为4.3左右，因此，壳聚糖絮凝脱蛋白不必对大枣多糖溶液pH进行调整.

图2 絮凝温度对大枣多糖蛋白脱除率 和多糖损失率的影响

图3 絮凝pH对大枣多糖蛋白脱除率 和多糖损失率的影响

2.4 絮凝时间对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响

图4为絮凝时间对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率的影响.图4中结果表明，在10～30 min时，蛋白质脱除率增长较快，当絮凝超过30 min，蛋白质脱除率基本不变，此时壳聚糖与蛋白质之间已达到吸附平衡，再增加絮凝时间对蛋白质絮凝效果基本没有影响，反而会增加多糖损失.因此，综合考虑各项因素，选择壳聚糖絮凝时间为30 min.

图4 絮凝时间对大枣多糖蛋白脱除率 和多糖损失率的影响

2.5 正交试验结果

表2和表3分别为壳聚糖絮凝脱除大枣多糖蛋白质正交试验结果的极差分析和方差分析.综合考虑大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率，采用综合加权评分法，权重系数均为0.5.为了使得综合评分越高代表蛋白脱除率高并且多糖损失率低，因此以蛋白脱除率和“100-多糖损失率”中最大的指标定为100分，其它各试验号按下式评分：

综合评分= 蛋白质脱除率/68.17×100×0.5+(100-多糖损失率)/(100-31.18)×100×0.5

结果表明：壳聚糖法脱除大枣蛋白质的最佳工艺条件为A1B2C2.其中3个因素对大枣多糖蛋白脱除率和多糖损失率综合评分的影响顺序为A>B>C，即壳聚糖添加量影响最大，其各水平间之有显著性差异，其次是壳聚糖絮凝温度，最后是壳聚糖絮凝时间.

表2 正交试验结果极差分析

表3 正交试验结果方差分析

按壳聚糖添加量2 mg/mL，絮凝温度为50 ℃，絮凝时间为30 min的最佳工艺进行三组平行验证性试验，试验结果见表4所示.结果表明，在最佳脱蛋白工艺条件下，大枣多糖蛋白脱除率为66.32%，多糖损失率为34.10%，并且多糖颜色变浅，说明壳聚糖在絮凝脱蛋白的同时，还具有一定的脱色效果.

表4 验证性试验

3 结论

(1)壳聚糖絮凝法脱除大枣多糖蛋白质效果明显，但同时大枣多糖有一定的损失.壳聚糖絮凝脱除大枣多糖蛋白的适宜条件为：壳聚糖添加量为2.0 mg/mL ，絮凝温度为50 ℃，絮凝时间为30 min.此时,大枣多糖蛋白脱除率为66.32%，多糖损失率为34.10%.

(2)壳聚糖法脱除大枣多糖蛋白质最主要的影响因素是壳聚糖的用量.壳聚糖在絮凝除蛋白的同时，还具有一定的脱色作用.

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