神经退行性疾病治疗中靶蛋白GPR 17与其激动剂和拮抗剂相互作用的分子模拟

叶 桓 刘 述

神经退行性疾病治疗中靶蛋白GPR 17与其激动剂和拮抗剂相互作用的分子模拟

叶 桓 刘 述

目的 寻找高选择性的GPR 17受体的拮抗剂对于神经退行性疾病的治疗具有重要意义。方法 本研究经过对GPR 17三维结构的长时程分子动力学模拟后，利用AutoDock软件将GPR 17的激动剂UDP（二磷酸尿苷），拮抗剂MRS 2179对接进活性口袋中，并分析其结合模式。结果 GPR 17的核苷酸结合口袋相似于其他P 2Y受体，拮抗剂UDP，MRS 2179能特异地与GPR 17结合，形成稳定的复合物构象，其中Arg 255在配体识别过程中起到关键作用。结论 本研究为设计新型的GPR 17受体拮抗剂提供了理论指导。

神经退行性疾病；GPR 17；分子对接；分子动力学

神经退行性疾病如老年性痴呆（AD）的病理特征为Aβ多肽沉积在神经元周围，神经元内Tao蛋白异常磷酸化，小胶质细胞被激活，产生慢性炎症，导致脑内大量神经元坏死，促进神经再生可能是治疗老年性痴呆等神经退行性疾病的有效途径[1-4]。

目前，关于GPR 17受体的中枢作用研究表明，GRP 17受体是脑和脊髓损伤的感受器，损伤后GPR 17表达会升高，拮抗GPR 17表达能减轻脑缺血损伤和脊髓损伤，发挥神经保护作用[5-6]。目前，还没有GPR 17的特异性拮抗剂，开发GPR 17的拮抗剂可能是治疗神经退行性疾病的一条新的有效途径。分子进化研究表明，GPR 17位于系统发育的两大受体家族，P 2Y核苷酸受体和半胱氨酰白三烯(Cys-LT)受体家族的中间位置，可以被内源性配体半胱氨酰白三稀及细胞外核苷酸所激活，引起腺甘酸环化酶抑制和细胞内钙离子释放增加。细胞外核苷酸是与种系发育相关的重要的细胞外信号分子，这类物质失调与炎症性疾病包括脑缺血密切相关，细胞外核苷酸包括腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)以及糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等。

GRP 17作为一种G蛋白偶联受体，具有七螺旋跨细胞膜结构（TM）（如图1），然而，GRP 17的晶体结构尚未被解析，本研究只能采用同源建模的方法获得GPR 17的三维结构，通过长时程的分子动力学模拟后，将小分子二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)激动剂和MRS 2179拮抗剂对接进GRP 17受体的结合口袋中，讨论细胞外信号分子激活G蛋白偶联受体的分子机理，为开发治疗老年性痴呆等神经退行性疾病的新药提供指导。

图1 GPR 17的蛋白分子结构

1 材料与方法

1.1 小分子配体文件的准备 在Chemdraw 软件中画出UDP和MRS 2179的结构图，并以MDL Molfile(*.mol)格式存储（见图1）；使用OpenBabel 软件导入已经建立的格式文件，使用其convert功能，将小分子转换成为SYBYL Molfile(*.mol 2)的三维结构格式文件。量子化学软件MOPAC在AM 1水平上对小分子的构象进行能量优化，而且加上原子净电荷（partial charge）。

1.2 大分子受体蛋白的分子动力学模拟 GPR 17的UNIPROT编号为Q 13304，共有367个氨基酸。登陆GPCRRD数据库（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ GPCRRD/），下载采用GPCR-I-TASSER算法构建的GPR 17的三维模拟结构(具体流程如图3)。研究人员通过此算法已经构建了1028个人类GPCR的三维结构。然而采用GPR 17的人工三维模拟结构还不能直接用于分子对接。为了模拟真实情况，在进行分子对接之前，本研究采用由美国伊利诺斯大学开发的分子动力学模拟程序包NAMD 2.9（http://www.ks.uiuc.edu/ Research/namd/），将GPR 17插入磷脂双层膜（DPPC膜，二棕榈酸磷脂酰胆碱）中，进行长时程的分子动力学模拟。模拟体系用VMD 软件（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）构建，在膜蛋白体系的上下层中加入水分子（2 nm厚），水分子采用TIP 3P模型；为了保证体系的电中性，加入浓度为0.15 M的KCL溶液（生理离子浓度）来中和体系，整个体系有367个氨基酸，133个磷脂分子，3047个水分子，27个阳性钾离子，45个阴性氯离子，共有60301个原子。模拟过程中温度保持在300 K，同时保持1个大气压的恒压。为使该体系达到平衡，首先固定磷脂头部和蛋白质，用最陡下降法进行 1000 步的能量优化来优化磷脂尾部和水分子，然后固定磷脂尾部和蛋白质对磷脂头部和水分子继续进行1000步能量优化。体系平衡后进行5 ns分子动力学模拟，采用的是CHARMM 36力场[7]。

图2 UDP和MRS 2179的化学结构式

图3 GPCR-I-TASSER算法流程图

1.3 分子对接 GPR 17受体经过5 ns分子动力学模拟后，挑选一个合适的蛋白构象用于分子对接，采用国际上广泛使用的免费分子对接软件AutoDock 4.0（http://autodock. scripps.edu/），对接前，将GPR 17蛋白加极性氢，加Kollman United点电荷，保存为macro.pdbq文件。利用Autogrids程序设定格点（grid），为了探索GPR 17的活性口袋，我们将将格点平均数设为150×150×150，格点空间距离为0.375，用mkgpf 3程序生成.gpf文件。将小分子UDP和MRS 2179的原子类型汇总，输入的参数准备gpf文件和dpf文件，在dpf文件中，“ga_num_evals”和“ga_num_evaluations”用于限定程序收敛条件，决定运算费时长短。将ga_num_evals=10000000；ga_ run=100（默认10）；ga_pop_size=300（默认150）；其余参数采用AutoDock 4.0的默认值。对接后，将受体-配体复合物再进行5 ns的分子动力学模拟，具体参数同上。

分子动力学模拟计算在Linux集群系统上应用GPU/ CUDA技术完成。

2 结果

GPR 17受体的动力学优化在模拟的磷脂双层膜中进行（如图4）。分子动力学结果表明，优化体系达到平衡后，进行5 ns的分子动力学模拟，根据对均根方差（RMSD）的观察，可以看出该蛋白结构已经达到稳定。分子对接后，再进行5 ns的分子动力学模拟，蛋白复合物也达到稳定（如图5）。

图4 GPR 17受体的分子动力学模拟体系。

GPR 17位于P 2Y核苷酸受体和半胱氨酰白三烯受体家族的中间位置，通过研究P 2Y受体的结合位点可以为研究GPR 17与配体结合提供依据。研究表明，GPR 17的核苷酸结合区与P 2Y受体的核苷酸结合区位置相同，核苷酸结合口袋位于TM 3，TM 5，TM 6 and EL 2之间[8-9]。根据以往研究，对于所有的P 2Y-核苷酸受体配体复合物，核苷酸配体的磷酸盐部分容纳在由三个氨基酸3.29（第3个跨膜螺旋第29个氨基酸，余以此类推），7.39 和6.55组成的阳性离子口袋中，GPR 17的氨基酸Arg 283对应于氨基酸 6.55，Gly 136对应于氨基酸3.29，Ser 311对应于氨基酸7.39，虽然Gly 136不能显示支链的相互作用，但能提高支链的柔性。通过研究多个P 2Y 受体的EL 2（细胞膜外第2个loop，余以此类推），在GPR 17受体EL 2上存在一个重要的酸性氨基酸Glu 202，位于两个保守的半胱氨酸之前，对于稳定受体配体复合物起到重要作用。

图5 GPR 17受体分子动力学模拟体系的RMSD

图6 分子对接结果

通过诱变研究P 2Y 1受体，氨基酸3.29和Asp 232 (EL 2)参与了由配体引起的受体激活，同时氨基酸3.29参与了与Glu 207(EL 2)的离子相互作用，这对于保持受体的基础状态非常重要。核苷酸的磷酸部分与Arg 131的支链相互作用，可以使Arg 131-Glu 207离子对去稳定化，参与了受体激活。在GPR 17 TM 3上的氨基酸Arg 133，靠近氨基酸3.29，作为一个保守的阳离子氨基酸，Arg 133与Tyr 41，Tyr 200和Ser 224的支链形成一个稳定的相互作用。在GPR 17，靠近氨基酸3.29的负离子氨基酸是Gln 211，能与Tyr 144 S，Ser 224和His 220形成稳定的氢键。

分析分子对接的结果，小分子二磷酸尿苷(UDP)是GPR 17的天然配体之一，可作为激动剂激活GPR 17受体，UDP与GPR 17的结合模式在图6显示，GPR 17的核苷酸结合位点与UDP的二磷酸盐存在多个相互作用，使二磷酸盐在活性口袋内稳定；Arg 283(6.55)的胍基部分和α和β-磷酸形成离子键；β-磷酸和Tyr 213(EL 2)，Tyr 140(TM 3)和Tyr 290(EL 3)的羟基形成一个氢键网络，并与His 280 (TM 6)的支链相互作用；Gln 211(EL 2)与α-磷酸和β-磷酸结合；EL 2上的Gln 199，其支链指向细胞膜内，在活性口袋内接近UDP的磷酸部分，同时，His 220(TM 5)，Tyr 144(TM 3)，Ser 224(TM 5)和Tyr 279(TM 6)的支链也位于口袋内。UDP的鸟苷环部分，主要与TM 1和TM 7的氨基酸存在极性相互作用，尿嘧啶的4-O部分与Ser 311(TM 7)和Tyr 66 (TM 1)的羟基部分作用，而3-NH部分与Ser 315(TM 7)作用；UDP的鸟苷环部分在活性口袋中存在大量疏水相互作用，包括与Tyr 179，Phe 139，Phe 276和Tyr 140；Asn 204（EL 2）和Ser 311(7.43)存在一个氢键，结构保守的氨基酸Ser 311(7.43)，Tyr 66(1.39)和Phe 139(3.32)可以通过静电相互作用固定尿嘧啶碱基，此外，保守的Arg 283(6.55)也参与结合UTP的尿嘧啶碱基。UDP的糖基部分与GPR 17的7 TM区域存在特殊联系，核糖的2'-OH部分与Asn 142(3.55)和Thr 314(7.42)形成氢键，3'-OH指向TM 6，但是没有直接参与任何特殊的氢键。

本研究还模拟了一个选择性P 2Y受体拮抗剂MRS 2179与GPR 17的相互作用，MRS 2179作为核糖核苷酸类似物，结合在GPR 17受体同样的口袋中，如图5，MRS 2179的磷酸部分与Arg 255残基存在有静电相互作用，而且，3'和5'磷酸链通过氢键稳定在口袋中。3'-磷酸部分形成氢键通过His 280(TM 6)的支链(N 1)；Tyr 144(TM 3)的羟基部分与3'-磷酸部分的氧原子相互作用。Gln 211(EL 2)的NH 2部分与MRS 2179的3'-磷酸部分形成氢键。The 5'-磷酸部分与Tyr 213(EL 2)，Thr 203(EL 2) and Tyr 279 (TM 6)的羟基部分形成氢键。

MRS 2179的腺嘌呤部分，N 7与Arg 115(TM 2)相互作用，N 6与Ser 7.43(TM 7)相互作用，N 1与Asn 142(TM 3)相互作用，N 3与Phe 139的骨架相互作用。在活性口袋中，Phe 139和Phe 276残基的疏水部分容纳核苷。

对于UDP和MRS 2179，一个主要的相互作用参与磷酸部分 (尤其是α-磷酸)与碱性Arg 283残基。总之，受体的主要功能区结合UDP，MRS 2179重叠。尿苷的原子1与腺嘌呤的N 9重叠，MRS 2179的3'-磷酸部分与UDP的α-磷酸部分重叠，然而核糖占据相同空间区域在螺旋束中间。

总之，对于UDP，尿嘧啶环与TM 7，TM 3和TM 1结合，指向TM 1和TM 2，双磷酸部分与TM 3和TM 6结合，并指向TM 5，TM 6和EL 2。对于MRS 2179，腺嘌呤环结合TM 7和TM 3并指向TM 1和TM 2，磷酸部分结合在TM 3、TM 7、TM 6和EL 2，5'-磷酸指向EL 2，3'-磷酸指向TM 5和TM 6。

3 讨论

在大鼠局灶性缺血模型，体内敲除GPR 17基因或者注射P 2Y/CysLT拮抗剂可以减少缺血损伤的进程，揭示GPR 17是一个新型的神经治疗靶点。研究GPR 17的结构和配体结合机制对于研发选择性和潜在的药物是非常必要的。

目前大多数研究GPR 17是通过基因干扰等手段，然而对其结构的构建与分析必须借助计算机模拟的方法，研究表明，在1321 N 1细胞，异源性表达GPR 17，阻滞白三烯结合位点采用CysLT 拮抗剂并不能取消尿嘧啶的反应，然而，阻滞核苷酸位点可以允许白三烯LTD 4起反应[10-11]，这些现象仅通过生物实验是无法揭示其机制的。

本研究采用计算机分子模拟的方法，采用同源模建的方法构建的GPR 17三维结构，将其置于磷脂双膜中进行长时程的分子动力学模拟，然后将激动剂以及拮抗剂分别对接进GPR 17的活性口袋中。计算机模拟的方法可以将分子的微观世界形象表达出来，不仅直观准确，而且节约了人力物力，特别是对于一些实验室无法开展的生物实验更具优势。

GPR 17作为一个新型的“双杂交受体”，我们的计算机模拟研究帮助设计双靶向配体治疗神经退行性病变，随着技术不断进步，对中枢神经系统内GPR 17分子特性以及作用的深入研究，必将推进中枢神经系统疾病的研究进展，并且也为寻找防治手段开辟新的途径。

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Objective Looking for a high selectivity GPR 17 receptor antagonists for the treatment of neurodegenerative diseases is of great significance. Methods This study on GPR 17 three-dimensional structure after long time history of the molecular dynamics simulation, Use AutoDock software will GPR 17 agonist UDP (ii) uridine phosphate, antagonists MRS 2179 butt into active pocket, and analyzes the combination model. Results GPR 17 nucleotides in combination with pockets, similar to other P 2Y receptors antagonists UDP, MRS 2179 can combine with GPR 17, specific form stable complex conformation, including Arg 255 played a key role in the process of ligand recognition. Conclusion This study for the design of new GPR 17 receptor antagonists provides theoretical guidance.

Neurodegenerative diseases; GPR 17; Molecular docking; Molecular dynamics

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.33.001

广东省自然科学基金 (S 2012010009215）

安徽 510080 安徽省儿童医院神经外科 （叶桓） 230032 安徽医科大学人体解剖学教研室；广东 510080 中山大学中山医学院人体解剖学教研室（刘述）

刘述 E-mail：mrliushu@126.com