植物细胞培养实验在细胞工程实验教学中的应用

徐根娣，邵邻相，吴旭峰，赵甘戬

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004;2.浙江师范大学地理与环境科学学院，浙江金华 321004)

植物细胞的培养在生物技术专业的许多课程中都有涉及.细胞工程是生物技术专业的重要专业必修课之一，实验课在整个课时中占有较大的比例，而植物细胞的培养自始至终都是这门课程的重要和关键的组成部分.除此之外，细胞生物学、植物体细胞遗传学、遗传学、基因工程下游技术、分子生物学、生化制药技术、植物生物学和组织培养等课程的实验课都涉及到植物细胞的培养［1］，植物细胞培养实验方案的质量直接影响着教学质量的高低，也是提高学生动手能力的关键所在.因此，有必要对植物细胞培养的实验技术进行研究和探索，以更好地应用于细胞工程实验教学，为学生今后从事生物学领域的相关研究，进入与细胞工程有关的生物技术产业奠定必要的理论和技术基础［2-3］.

利用植物细胞大规模悬浮培养生产植物有用的代谢产物在近些年来取得了很大的发展［4-6］，但这些技术和方法往往实验周期长并且影响因素较多，对本科实验教学而言，由于学时的限制，植物细胞的培养不可能进行全新的探索.因此，开发适合本科实验教学的综合实验，制订具体化和可操作性的植物细胞培养方案，使生物技术专业的学生既能学到操作技术，培养其动手能力，又能引导他们根据所学知识进行切实可行的创新，提高其分析和解决问题的能力.

1 植物细胞培养实验的实施过程

1.1 实验设计和材料准备

实验教师根据实验室的仪器设备、药品、耗材等情况，提供大叶黄杨(Euonymus japonicus)、七子花(Hepatcodium miconioides)、紫花地丁(Viola philippica)、大豆(Glycine max)、牵牛花(Pharbitis nil)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)、鸢尾(Iris bungei)、鸭趾草(Commelina communis)、一年蓬(Erigeron annuus)、北美车前(Plantago virginica)和加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)等植物的嫩叶.学生根据自己的兴趣自愿组合，3～4人为一小组，查阅文献，写出实验方案，内容包括:实验意义和目的、实验材料和方法、实验植物种类、仪器、试剂和实验步骤、预期结果等.经全组同学讨论后，最终确定选择的植物材料为大叶黄杨、七子花、紫花地丁.

1.2 细胞培养实验的实施

整个实验过程在老师的指导下，由每组学生分工协作独立完成.实验过程如下:

1)愈伤组织的诱导和培养

取大叶黄杨、七子花、紫花地丁的嫩叶，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗一遍.在无菌条件下，用75%乙醇溶液浸渍30 s，再用1.5 g/L HgCl2溶液消毒5～8 min，无菌水冲洗4～5次，用滤纸将多余水分吸干，然后将顶芽和侧芽切成约1 cm的小段、叶片切成约0.5 cm2的小块，接种于附加有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)或玉米素的琼脂固化MS培养基(蔗糖20 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8)上，置于(25±1)℃培养，以诱导愈伤组织.

2)植物细胞的悬浮培养

用镊子夹取继代4～5次生长良好的疏松型胚性愈伤组织为材料进行细胞悬浮培养，并将愈伤组织轻轻夹碎.在250 mL三角瓶中，加入约60 mL的MS液体培养基(蔗糖20 g/L，琼脂6 g/L，pH 6.0)，分别附加有1，2 和3 mg/L 2，4-D 和0.4 mg/L 6-BA.每瓶接种1.5 ～2.0 g鲜愈伤组织，在100 r/min恒温旋转式摇床上进行悬浮培养，培养温度为(28±1)℃.

3)细胞记数及形态观察

取细胞悬液，加入2倍体积的80 g/L CrO3溶液，置于70℃水浴中处理15 min.冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液以使细胞分散，混匀后，取一滴悬液置于血细胞记数板上记数.将培养有细胞悬液的细胞培养瓶置于倒置显微镜上，观察并拍照.

2 植物细胞培养实验的实施效果

实验实施过程中，除了教师的正确指导外，还要求学生进行正确操作、仔细观察和认真分析.例如，在外植体消毒接种时，对无菌操作的要求非常高，一不小心，就可能污染导致实验失败.有的学生很不耐烦，甚至想放弃，经过教师的鼓励，学生明白了科学实验是不断探索的过程，期间会出现难以预料的情况，需要自己去解决.另外，实验结果要求以图、表及照片的形式呈现，实验数据须做统计学处理.由于各小组学生所选的实验材料不同，结果也有差异.

2.1 愈伤组织的诱导及培养

1)大叶黄杨的叶片及芽接种后约12 d开始出现愈伤组织，且19 d后愈伤组织较为明显，进行第1次继代，以后每隔10 d继代一次.大叶黄杨愈伤组织培养前期的生长速率较慢，继代2次后愈伤组织生长速率迅速加快，继代4次后形成大量的质地疏松、乳白色的愈伤组织.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同处理的结果最为理想(见表1).

表1 不同浓度激素对植物幼叶愈伤组织诱导率的影响

2)七子花的叶片接种后第14 d开始出现愈伤组织，第1次转接以后每隔10 d继代一次.1次继代后愈伤组织的长势依然很弱;经过约3～4次继代，愈伤组织长势逐渐好转，愈伤组织团增大;约继代6次后，形成较大的愈伤组织团，外观呈致密的白色霜状团块.1.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同处理的诱导率可达74.0%(见表1).但在培养过程中外植体和愈伤组织均出现褐变现象，并且随培养时间的延长褐变程度逐渐加深.

3)紫花地丁愈伤组织的诱导周期为10 d，每12 d继代一次.所得愈伤组织为淡黄绿色颗粒，质地较致密，且生长状况良好.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同处理的结果最为理想(见表1).

2.2 植物细胞的悬浮培养

1)取继代4次的大叶黄杨乳白色疏松愈伤组织进行悬浮培养.发现:初期细胞的生长速度较慢，1周后仍未发现细胞明显增殖;继续培养2周后细胞增殖显著，此时可观察到形态清晰的单细胞(见图1中A)、细胞团(见图1中B)及变形细胞(见图1中C)，细胞记数结果为2.46×103个/mL.每3 d记数1次，所得的细胞生长曲线如图2所示.培养过程中出现轻度的褐变，且随培养的进行，褐变程度有逐渐加深的趋势.但细胞分裂继续旺盛进行，培养21 d后，悬液呈现浅褐色.

2)将经过3次继代的七子花愈伤组织放入液体培养基中震荡培养，此时的愈伤组织较致密，因此需在悬浮培养前先将愈伤组织用镊子夹碎.2周后进行细胞观察，七子花悬浮培养所得的变形长细胞顶端有月牙状勾起，与其他植物变形细胞的差异明显(见图1中D).比较而言，七子花的细胞增殖速度较大叶黄杨缓慢，且变形细胞数量较多，细胞的集群性也更为明显(见图1中E和F).

3)紫花地丁的愈伤组织培养7 d后有悬浮单细胞或小细胞团出现(见图1中G，H和I)，且在显微镜下可观察到变形的长细胞.继代培养时，加入等量的新鲜培养液，摇匀后稍静置，待大细胞团块沉降后分瓶，不需要过滤即可得到不含大细胞团块的培养物［7］.此时细胞记数的结果为1.32×103个/mL.

3 植物细胞培养实验的反思

3.1 植物材料选择是实验成败的关键因素

通过对几种校园内常见植物的细胞培养的初步研究，发现大叶黄杨的愈伤组织长势最为旺盛，质地也最为疏松.紫花地丁的愈伤组织质地较致密，且生长状况良好，培养过程中只出现少量褐变现象.因此，细胞悬浮培养材料以大叶黄杨、紫花地丁最为理想.

图1 大叶黄杨、七子花和紫花地丁的单细胞和细胞团

图2 大叶黄杨、七子花和紫花地丁的细胞生长曲线

大叶黄杨为黄杨科植物，在南北方栽培都极为广泛［8］，易栽易活，冬夏常青，取材方便，实验不受季节限制，且组织培养和悬浮培养的效果都较好，是不可多得的用于本科实验教学的优良实验材料.悬浮培养时的紫花地丁出现轻度褐变现象，估计是悬液中的激素浓度、摇床转速、培养温度等因素对多酚氧化酶(PPO)的生成及活性有一定的影响［9］.另外，由于植物细胞对剪切力敏感［10］，悬浮培养中摇床的旋转形成的剪切力［11］易造成对细胞的伤害，主要是对植物细胞壁的破坏，从而使PPO含量升高，这也是悬液发生褐变的原因之一.悬浮培养过程中，学生发现有3瓶紫花地丁悬液发生杂菌污染，但悬液中的细胞并没有死亡，且细胞增殖依然快速进行，因此初步判定此培养液中带入的杂菌为共生菌，并不明显影响紫花地丁悬浮细胞的生长.七子花的细胞培养尚未有成熟的方案.作为国家二级重点保护的濒危植物，七子花细胞培养方法的探索对七子花种群的扩大及恢复有着重要的意义［12］.由于在组织培养中七子花的褐变现象严重，不适于本科教学的细胞培养实验.

3.2 通过综合实验培养学生应用知识解决问题的能力

通过植物细胞培养的综合实验，可以提高学生的实际操作能力，例如熟练使用显微镜、解剖器等.同时，通过聆听、观察、阅读、质疑、记录和分析实验结果，逐步提高学生的观察能力.在细胞培养实验中，植物细胞代谢缓慢，因而生长速率低，需要很长时间的培养过程，而且长时间保持无菌状态给培养带来难度，尤其在悬浮培养过程中极易发生污染，因此，在实验过程中十分强调无菌操作，这就大大提高了学生实验过程中的耐心与细心.另外，对实验结果的整理过程，通过表解、图释记录实验的结果，对实验现象进行分析整理，找出实验成败的原因，并通过查阅文献等解释实验现象，进一步提高了学生分析和解决问题的能力.

3.3 因地制宜，灵活安排实验进度

由于植物细胞培养中涉及的许多实验材料都易受区域性、季节性的影响，所以在制定学期或学年实验计划时必须要对全程教学内容中所需的实验材料、药品等有一个全盘的计划和安排［13］.实验指导教师应制定出实验的具体日程，及时采集、购买或培养实验材料.在指定实验计划时应根据植物的不同生长期，适当调整实验次序，制定适宜的实验计划.准备的实验材料尽可能与教材的要求相一致.实验材料应该尽量新鲜，实验前必须保证仪器完好，药品、材料准备充足，以保证实验课圆满地完成.

4 结束语

植物细胞培养实验应用于细胞工程的实验教学，实验采取小组制，加强了学生间的团结，也锻炼了学生进行分工合作、统筹安排的能力.在提供足够的材料时，能让每个人都有机会学习，克服了在以往的教学中因为采取小组制使某些人没有动手机会的现象.由于植物细胞培养时间较长，可以在继代培养时穿插其他实验，尽量把材料的继代时间安排为每周一次，这样就在正常的实验课时段进行实验，不用另外抽时间进行，可以保证高质量、高效率地完成各项实验.总之，通过植物细胞培养综合实验的应用，可以使学生掌握较多的细胞工程实验方法，锻炼他们应用科学知识分析和解决问题的能力，培养其团队协作和创新精神.

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