宝坻大蒜气生鳞茎和花粉母细胞发育的细胞学研究

彭爱芳，王 珍，李转春，任春雪，范宝莉，刘晓颖，王振英，彭永康

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

大蒜（Allium sativum L.）属百合科（Liliaceae）葱属（Allium），为2年生草本植物.多数大蒜品种采用无性繁殖，很难获得或创造可育的大蒜材料进行杂交育种.近年来，育种工作者搜集了大量的大蒜种质资源，发现了可育的大蒜资源并成功进行了种子生产，但大蒜实生种子活力较弱，子代鳞茎大小不同且多是“独头蒜”，严重影响其质量和产量，使育种的经济效益较低[1].目前，大蒜的育种研究主要集中在自然突变或人工诱导突变[2]、体细胞无性系变异[3-6]等方面，然而导致大蒜不育的原因目前尚无定论.

天津宝坻大蒜“六瓣红”为春播大蒜品种，具有较高的营养价值[7].课题组以宝坻大蒜为实验材料，对气生鳞茎的发育、花粉母细胞减数分裂过程中染色体的异常行为、花粉粒育性进行观察,并从细胞学角度对大蒜不育的原因作了初步探讨.这一研究可为进一步开展大蒜的细胞遗传及有性杂交育种提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

宝坻大蒜“六瓣红”，春天种植于天津师范大学生物科技园，株距8～10 cm，行距28 cm.

1.2 实验方法

1.2.1 形态学观察

从大蒜花芽开始分化至花衰老，每天随机取5个花序的10个花蕾进行花发育的形态学观察.每个发育时期，解剖镜下对5朵花进行破坏性形态学分析[8].

1.2.2 减数分裂观察

每天取样10株，将大小适宜的花蕾置于卡诺氏固定液（无水乙醇∶冰乙酸=3∶1体积比）中固定，次日转至体积分数为70%的酒精中.在解剖镜下剥取幼小花蕾中的雄蕊，然后用卡宝品红染色法制片，在光学显微镜下镜检，拍摄花粉母细胞各时期的图像，统计减数分裂进程中花粉母细胞内出现异常情况的频率[8-9].

1.2.3 花粉育性鉴定

随机取5个花序的10个花蕾，将成熟的花药压扁后放至培养基（质量分数0.01%的硼酸、质量分数10%的蔗糖和质量分数1%的琼脂）上，25℃暗培养24 h后，在光学显微镜下观察花粉的发育.

2 结果与分析

2.1 大蒜气生鳞茎的发育

大蒜气生鳞茎的发育过程如图1所示.

图1 大蒜气生鳞茎的生长发育过程Fig.1 Growth and developmental process of aerial bulbs in garlic

大蒜花芽和鳞芽分化期以后，蒜薹开始伸长，蒜薹先端总苞内的花迅速发育，总苞内着生有许多球状体，即为气生鳞茎.大蒜种植12周后，总苞内长出气生鳞茎，为半透明的球状体，直径约0.5 mm，如图1A所示.1周后，蒜薹抽出，气生鳞茎变为白色，直径约1 mm，如图1B所示.大蒜气生鳞茎充分吸取光合产物，急速膨大，1个月后大蒜总苞内的气生鳞茎数量约有70粒，最大直径为5 mm，长度可达1 cm，如图1C所示.大蒜总苞内有正常形态的花，由于受气生鳞茎的挤压，数量较少，每株约有8～15朵.

2.2 大蒜花的发育

大蒜花的发育过程如图2所示.

图2 大蒜花的发育Fig.2 Development of garlic flowers

大蒜具有正常形态的花，但不能结实，只能靠播种鳞茎进行无性繁殖.种植16周后，花处于闭合状态，花药呈绿色，完全包裹在绿色的花瓣内，花蕾长度为2.5～3.0 mm，花药长度不足1.0 mm，如图2A所示.此时，花粉母细胞处于减数分裂期.3 d后，花瓣伸长，花药变为黄色.花蕾长度约3 mm，花药长度约1 mm，如图2B所示，花粉母细胞减数分裂完成.大蒜种植17周后，花瓣变成粉红色，花药表现出轻微皱缩，花蕾长度为3.0～4.0 mm，如图2C所示.2 d后，花瓣变成紫色，花药皱缩严重，如图2D所示.随后，花瓣变成深紫色，花药完全干枯，如图2E所示.

2.3 大蒜花粉母细胞减数分裂过程及异常行为

2.3.1 大蒜花粉母细胞的减数分裂过程

大蒜花粉母细胞的减数分裂过程如图3所示.

减数分裂由2次细胞分裂组成，即减数分裂Ⅰ和减数分裂Ⅱ.前期Ⅰ的细线期，染色质开始凝集，染色质纤维逐渐折叠、螺旋化，密集簇拥到核的一边，如图3A所示；偶线期，细胞核内同源染色体联会，染色体开始逐步分散开，同细线期相比略微变短、增粗，但颜色较浅，如图3B所示；此时，由于同源染色体的联会配对，染色体进一步浓缩加粗，颜色加深，减数分裂进入粗线期，如图3C所示；双线期，染色体进一步螺旋化缩短变粗，配对的同源染色体彼此排斥并开始分离，但不完全分开，同源染色体的四分体结构清晰可见，如图3D所示；当减数分裂进行至终变期，染色体超螺旋化，形成8个高度浓缩、形态较为清晰的二价体，如图3E所示；中期Ⅰ时，核膜、核仁消失，纺锤体形成，染色体高度凝缩，同源染色体整齐地聚集在赤道板上，如图3F所示；后期Ⅰ，同源染色体对彼此分离并向两极移动，如图3G所示；末期Ⅰ，染色体到达两极后，逐渐发生去凝集，染色体周围核膜重新组装，形成2个子细胞核，同时，细胞质也开始分裂，形成2个间期子细胞，如图3H所示.

减数分裂Ⅰ结束以后，染色质在短时间内通过螺旋化缩短、变粗，进入前期Ⅱ，如图3I所示；到了中期Ⅱ，染色体显著缩短，每个染色体的着丝点排列在赤道板上，如图3J所示；后期Ⅱ可观察到位于赤道板上的姐妹染色单体向细胞两极移动，如图3K所示；末期Ⅱ染色体被拉向两极，染色体又变细长，形成4个圆形的新核，如图3L所示.随着细胞质的分裂和新细胞壁的形成，4个子细胞发育成四分体小孢子.

图3 大蒜花粉母细胞减数分裂不同时期的染色体特征Fig.3 Chromosome characteristics in different periods of meiosis of pollen mother cell in garlic

2.3.2 大蒜花粉母细胞减数分裂过程中的异常行为

大蒜花粉母细胞减数分裂过程中，染色体结构变异的出现频率较高，这与同样以营养繁殖为主的百合情况相似[9].本研究中约有27.4%的花粉母细胞在不同的发育时期呈现出各种染色体结构的变异现象，这些变异包括滞后染色体、染色体桥、染色体断片及微核等.统计的1 000个花粉母细胞中，滞后染色体出现频率为7.6%，主要存在于中期Ⅰ中，后期Ⅰ和后期Ⅱ有少量出现；染色体桥出现频率为9.3%，主要是单染色单体桥，极少数细胞出现2个染色单体桥；1.7%的细胞出现染色体断片，主要出现在后期Ⅰ；微核的出现频率最高，为9.7%，主要出现在末期Ⅰ和末期Ⅱ.此外，减数分裂过程中还有极少数细胞出现染色体不均等分离、多极分裂等异常现象，共占所统计细胞数量的0.7%.

减数分裂过程中染色体异常的具体情况如表1和图4所示.

表1 大蒜花粉母细胞减数分裂各时期染色体异常统计Tab.1 Statistic of abnormal pollen mother cells in each stage of meiosis in garlic

由表1可知，有3.9%的细胞在中期Ⅰ时染色体出现异常，主要表现为滞后染色体，如图4A所示，这些染色体未和其他染色体同时到达赤道板位置，而是游离于赤道板外.在后期Ⅰ时，有6.1%的细胞出现不同程度的异常，包括染色体桥、滞后染色体和染色体断片等异常行为，如图4B和4C所示，其中出现频率最高的是染色体桥，主要为单染色单体桥，有些花粉母细胞同时出现2种异常，一些染色单体桥会一直持续到末期Ⅰ，如图4D所示.滞后染色体，染色体断片在末期Ⅰ时形成微核，研究中观察到大量细胞出现微核，如图4E所示.后期Ⅱ中，有4.5%的花粉母细胞出现异常行为，表现出染色体滞后和染色体桥现象，如图4F和4G所示.末期Ⅱ时，仍然存在染色体桥，大量细胞出现微核现象，如图4H所示，这一时期，出现异常细胞的频率为6.3%.

图4 大蒜花粉母细胞减数分裂异常现象Fig.4 Abnormal meiosis of pollen mother cells in garlic

2.4 大蒜花粉的育性

观察宝坻大蒜的花药，发现适宜环境下，花粉粒未萌发出花粉管，如图5所示.这证明大蒜花粉粒没有育性.

图5 大蒜花粉粒萌发情况Fig.5 Germination of pollen in garlic

3 讨论与结论

宝坻大蒜具有正常形态的花，总苞内气生鳞茎数量多，长势快，由于受气生鳞茎的挤压，总苞内花的数量很少，仅有8～15朵.当花蕾长度为2.5～3.0 mm，花药长度不足1 mm时，花药呈绿色，可初步判断花粉母细胞处于减数分裂旺盛期，可以此作为取材依据.大蒜花药形态看似正常，但花粉未表现出育性.气生鳞茎急剧膨大对养分争夺强烈，致使花药在花期到来之前就全部干枯.

本研究通过观察大蒜花粉母细胞减数分裂过程，发现27.4%的花粉母细胞中出现滞后染色体、染色体桥、染色体断片和微核等异常现象.大蒜花粉母细胞在减数分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、后期Ⅱ和末期Ⅱ均有异常行为出现.中期Ⅰ主要是同源染色体的滞后，未和其他二价体同时到达赤道板位置，可能随机分离或落后于其他二价体，末期时会形成微核[8]；后期Ⅰ和后期Ⅱ，染色体异常细胞数量较多，多表现为滞后染色体、染色体桥和染色体断片，有少量细胞同时出现2种异常.染色体桥是减数分裂最常见的异常行为，可以作为鉴定染色体臂内是否出现倒位的依据之一.在后期Ⅰ和后期Ⅱ均观察到染色体单体桥，有些染色体桥会一直持续到末期，这类桥在倒位环内只有一次交换，倒位的一个遗传学效应是降低配子的育性，产生不均衡配子，导致配子不育.滞后染色体和染色体断片进入末期，会形成微核，减数分裂末期Ⅰ、末期Ⅱ观察到大量微核.除以上这些异常之外，减数分裂过程中还有极少数细胞出现染色体不均等分离、多级分裂异常现象.微核、不均等分离、多极分裂均可导致遗传物质的减少或增加，产生不育配子[9-10].

细胞减数分裂过程受一些基因严格控制，其中任何一个基因发生突变，都会导致减数分裂过程出现异常.大蒜长期进行无性繁殖，导致病毒的传递与积累，影响细胞内的生理、生化过程，诱发染色体结构变异，进而影响花粉母细胞减数分裂的正常进行[8-9].

导致大蒜不育的原因目前尚无定论.Pooler等[11]和Jenderek[12]认为发育中的花不能与气生鳞茎竞争营养物质，这种竞争结果导致了花粉的不育[13].本研究通过观察气生鳞茎和花器官的发育，发现由于开花期间气生鳞茎急剧膨大，受其挤压和对养分的争夺，发育中的花不能与气生鳞茎竞争营养物质，致使花药中途干枯，因此认为营养物质的缺乏可能是导致花粉不育的原因之一.Etoh[14]和Simon等[15]认为最根本的原因是染色体异常，他们观察到SAT染色体上缺少许多随体，因此推测大蒜染色体异常或缺失，虽能正常进行减数分裂，但小孢子退化，双核花粉失去活力.花粉母细胞减数分裂异常与花粉育性的相关性已经在百合（Lilium L.）[9]、毛车前（Plantago virginica L.）[16]、向日葵（Helianthus annuus L.）[17]等多种植物的研究中得到证实.本课题组通过研究大蒜花粉母细胞的减数分裂过程，发现存在滞后染色体、染色体桥、染色体断片和微核等异常现象，初步认为这些异常可能是导致大蒜花粉不育的重要原因之一.

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