TLR2基因多态性与中国汉族儿童结核病易感性的关联研究

徐 放 谢兰品 董雅坤 綦 辉 孙 琳 李洁琼 肖 婧 焦伟伟申 晨 申阿东

·论著·

TLR2基因多态性与中国汉族儿童结核病易感性的关联研究

徐 放1,3谢兰品2,3董雅坤2綦 辉1孙 琳1李洁琼1肖 婧1焦伟伟1申 晨1申阿东1

目的 探讨TLR2基因5个SNP位点多态性与中国汉族儿童结核病(TB)易感性的关联。方法 以2005年2月至2010年10月在北京儿童医院临床诊断和确诊的TB且排除其他肺部感染的病例作为TB组，并根据感染部位和严重程度分别分为肺TB亚组、肺外TB亚组和重症TB亚组、非重症TB亚组；以健康查体且除外TB的儿童作为对照组。应用高通量MassARRAY技术对于TLR2基因的5个SNP位点：rs3804099(等位基因C/T)、rs1898830(等位基因A/G)、 rs7656411(等位基因G/T)、 rs11935252(等位基因A/G)、rs7696323(等位基因C/T)行基因分型，比较5个SNP位点各基因型和等位基因频率在TB组和对照组的差异，同时采用显性遗传和隐性遗传模式分析各TB亚组与对照组基因型的差异。结果 TB组345例，平均年龄(5.6±4.7)岁，男219例；肺TB亚组151例(43.8%)，肺外TB亚组194例；重症TB亚组155例(44.9%)，非重症TB亚组190例。对照组385例，年龄(6.1±3.8)岁，男226例。Hardy-Weinberg检验提示TLR2基因的5个SNP位点在TB组和对照组的基因型分布均符合遗传平衡(P=0.154～0.992)。调整了年龄和性别因素后，rs3804099位点TC、CC型和C等位基因频率TB组和对照组比较，OR=0.929～1.071；rs1898830位点GA、GG型和G等位基因频率TB组和对照组比较，OR=1.100～1.411；rs7656411位点GT、TT型和T等位基因频率TB组和对照组比较，OR=0.812～1.110；rs11935252位点GA、GG型和A等位基因频率TB组和对照组比较，OR=0.497～1.189; rs7656323位点CT、CC型和C等位基因频率TB组和对照组比较，OR=0.888～1.034；，差异均无统计学意义(P均>0.05)。5个SNP按照显性和隐性遗传模式分析，各基因型TB组和对照组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。②TLR2基因的5个SNP位点在显性或隐性遗传模式下，基因型频率在肺TB亚组、肺外TB亚组和对照组比较，OR=0.737～1.326；重症TB亚组、非重症TB亚组和对照组比较，OR=0.675～1.248；差异均无统计学意义(P均>0.05)。③TLR2基因5个SNP位点在各染色体之间均无强连锁。结论TLR2基因的5个SNP多态性与中国汉族儿童TB易感性不存在关联。

结核病； 儿童；TLR2基因

研究发现感染了结核分枝杆菌(MTB)的个体，某些可为无临床表现的潜伏感染，某些可发展为活动型结核病(TB)，而TB病例中可根治抑或转化为难治性TB[1,2]，均提示宿主免疫应答的相关免疫基因在TB的发生发展中起着重要的作用[3]。Toll样受体位于单核细胞和巨噬细胞表面,是一种重要的模式识别受体，是巨噬细胞最早接触MTB的抗原递呈分子[4]。迄今为止,人类已发现了TLR1～TLR11共11个Toll样受体家族成员，其中TLR2基因及其信号通路更被认为在抗结核免疫中起着关键作用[5]。TLR2基因可识别存在于MTB细胞壁上的阿拉伯甘露糖PAMP和肽聚糖PGN等成分, 通过启动细胞内信号传导，激活转录因子和活化蛋白从而促使细胞因子表达，进一步诱导机体的特异性免疫应答。TLR2基因及其信号通路被认为是机体产生针对MTB非特异性和特异性免疫应答的重要途径[6～9]。

目前关于TLR2基因SNP位点与TB的易感性报道较少，且结论不一，缺乏中国人群的研究数据。本文采用病例对照研究设计，以首都医科大学附属北京儿童医院(我院)收治的TB患儿为病例组，非TB健康儿童为对照组，选取TLR2基因5个SNP位点进行分析，探讨其与儿童TB易感性的关联。

1 方法

1.1 伦理和知情同意 本研究经我院伦理委员会审核同意，并获得患儿监护人的知情同意。

1.2 TB诊断和分型标准 儿童TB的诊断参考“儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案(试行)”[10]，包括临床诊断和确诊TB病例。其中重症TB为全身播散型TB和结核性脑膜炎；非重症TB为除重症TB外的TB。

1.3 TB组病例来源和亚组 回顾性分析2005 年2 月至2011 年10 月在我院呼吸科住院治疗的TB病例，并调阅TB患儿的病史资料，符合以下条件者行TLR2基因检测：①TB确诊和临床诊断病例；②汉族；③有冻存血标本可以提取DNA者；排除：①TB外合并其他肺部感染的病例，如肺炎等；②TB部位和严重程度描述不完整的病例。并根据TB感染部位和严重程度将TB组分别分为2个亚组：肺TB亚组和肺外TB亚组；非重症TB亚组和重症TB亚组。

1.4 对照组来源 来自2010年8月至2012年9月我院门诊健康查体儿童，取生化检查的剩余血标本，并符合以下条件：①无既往TB史，除外TB感染；②X线胸片未见异常；③有PPD接种史；④汉族。其中对照组病例数和TB组病例数约1∶1匹配，年龄和性别尽量匹配。

1.5TLR2基因5个SNP位点分析

1.5.1 DNA 提取 取外周静脉血2 mL，EDTA 抗凝，采用Qiagen公司血液DNA 提取试剂盒提取DNA。

1.5.2 SNP的选择、引物设计以及SNP分型 SNP位点选择策略是以标签SNP为主，并且补充文献报道的SNP位点，共选择5个SNP位点(rs3804099，rs1898830，rs7656411，rs11935252，rs7696323)进入本文分析。标签SNP根据Hapmap数据库(http://www.hapmap.org)的中国人群数据得到，为了加强对于5′非编码区和3′非编码区的研究，选取标签SNP的范围在基因的5′端和3′端各延伸5 000 bp，引物设计见表1。本研究采用iPLEX GOLD (Sequenom MassARRAY®)对所选位点的引物设计，确保引物的特异性和反应的顺利进行。SNP分型采用美国Sequenom公司的高通量飞行质谱MassARRAY技术，按照说明书操作。

1.6 统计学方法 基因型和等位基因频率数据以百分比表示；率的显著性采用χ2检验；人群的群体代表性用Hardy-Weinberg平衡(HWE)分析，采用χ2检验；应用HWE检验分析TB组和对照组基因型频率是否符合遗传平衡；TB组和对照组的基因型及等位基因频率差异采用Logistic回归调整年龄和性别的影响；TB组及其不同亚组易感性均采用显性遗传和隐性遗传模式分别进行分析，Logistic回归分析各TB亚组与对照组基因型的差异。采用SNPStats 软件(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)和SPSS 18.0 软件(Chicago, USA)进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 TLR2基因的5个SNP位点选择和引物设计

2 结果

2.1 一般情况 370例TB患儿留有DNA样本，其中25例因合并除TB外的其他肺部感染、TB的严重程度数据缺失被排除，345例进入分析。平均年龄(5.6±4.7)岁；男219例，女126例；肺TB亚组151例(43.8%)，肺外TB亚组194例；重症TB亚组155例(44.9%)，非重症TB亚组190例。对照组385例，年龄(6.1±3.8)岁；男226例，女159例。TB组和对照组年龄、性别匹配(P分别为0.135和0.187)。

2.2TLR2基因连锁不平衡分析 图1显示，TLR2基因的5个SNP位点在各染色体之间均无强连锁。

2.3TLR2基因5个SNP位点基因型和等位基因在TB组和对照组的差异分析TLR2基因5个SNP位点分型图如图1所示。HWE检验提示TLR2基因的5个SNP位点在TB组和对照组的基因型分布均符合遗传平衡,rs3804099、rs1898830、rs7656411、rs11935252和rs7696323的P分别为0.154、0.992、0.979、0.412和0.855。

表2显示，调整了年龄和性别因素后，rs3804099位点TC、CC型和C等位基因频率TB组和对照组差异无统计学意义(OR=0.929～1.071)；rs1898830位点GA、GG型和G等位基因频率TB组和对照组差异无统计学意义(OR=1.110～1.411)；rs7656411位点GT、TT型和G等位基因频率TB组和对照组差异无统计学意义(OR=0.812～1.110)；rs11935252位点GA、GG型和G等位基因频率两组差异无统计学意义(OR=0.497～1.189); rs7656323位点GG、GT型和G等位基因频率两组差异无统计学意义(OR=0.888～1.034)；P均>0.05。5个SNP位点按照显性和隐性遗传模型分析，各基因型频率两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1TLR2基因SNP位点的连锁不平衡分析

Fig 1 LD plot of 5 SNPs inTLR2 gene in Chinese Han population

图2TLR2基因SNP位点分型图

Fig 2TLR2 gene SNP classification

表2 TB组和对照组TLR2 5个SNP位点基因型和等位基因频率比较[n(%)]

Tab 2 Comparison ofTLR2 gene polymorphisms between two groups[n(%)]

GenotypeControl(n=385)TB(n=345)OR(95%CI)P1)rs3804099：CAAAAAGTTTGAAGTCAATTCAGAA[C/T]GTAAGTCATCTGATCCTTCATATGATT175(45．5)163(46．6)ReferenceTC178(46．2)155(44．3)1．071(0．625-1．833)0．803CC32(8．3)32(9．1)0．929(0．685-1．260)0．636DominanthereditymodelCC+TC210(54．5)187(48．7)1．052(0．786-1．409)0．734TT175(45．5)163(46．6)ReferenceRecessivehereditymodelCC32(8．3)32(9．1)0．900(0．538-1．508)0．690TC+TT353(91．7)318(82．8)ReferenceAlleleT528(68．6)481(68．7)ReferenceC242(31．4)219(31．3)0．993(0．797-1．237)0．952rs1898830：ATAGTAAAATAAATCCAGAGAAATC[A/G]GAACAGGGGAAATAATAATATAAGAAA111(28．8)82(23．4)ReferenceGA189(49．1)196(56．0)1．168(0．763-1．789)0．475GG85(22．1)72(20．6)1．411(0．994-2．003)0．054DominanthereditymodelGG+GA274(71．2)268(69．8)0．748(0．536-1．044)0．088AA111(28．8)82(23．4)ReferenceRecessivehereditymodelGG85(22．1)72(20．6)0．917(0．648-1．297)0．624GA+AA300(77．9)278(72．4)ReferenceAlleleG398(51．7)380(54．3)1．110(0．904-1．363)0．319T372(48．3)320(45．7)Referencers7656411：TTTTTAAGCAAATATATACCTAGAG[G/T]TTCCTCATAATGACTCAAAAATAGTGG105(27．3)103(29．4)ReferenceGT188(48．8)174(49．7)0．812(0．538-1．226)0．321TT92(23．9)73(20．9)0．926(0．657-1．305)0．662DominanthereditymodelTT+GT280(72．7)247(64．3)1．225(0．815-1．554)0．474GG105(27．3)103(29．4)ReferenceRecessivehereditymodelTT92(23．9)73(20．9)1．174(0．827-1．666)0．370GG+GT293(76．1)277(72．1)ReferenceAlleleG398(51．7)380(54．3)1．110(0．904-1．363)0．319T372(48．3)320(45．7)Referencers11935252：ACAAAGAATAACACTGGTTCATCAG[A/G]TAAGAGAGACCTTTTTCTGCTGTCTGG21(5．5)10(0．029)ReferenceGA132(34．3)118(33．7)0．497(0．228-1．081)0．078AA232(60．3)222(63．4)0．916(0．671-1．250)0．597DominanthereditymodelAA+GA364(94．5)340(88．5)1．165(0．863-1．573)0．319GG21(5．5)10(2．9)ReferenceRecessivehereditymodelAA232(60．3)222(63．4)1．951(0．903-4．215)0．089GG+GA153(38．7)128(33．3)ReferenceAlleleG174(22．6)138(19．7)ReferenceA596(77．4)562(80．3)1．189(0．925-1．529)0．177

续表2

Notes TB: tuberculosis group; ORs were adjusted for sex and age in the control groupvsTB group in a logistic regression model. Significant differences were indicated byPvalue <0.05. ORs andPvalue were the results by comparing the SNPs′ genotypes, dominant model, recessive model, alleles with the reference

2.3TLR2基因SNP位点基因型在TB各亚组及对照组间差异分析 如表3所示，TLR2基因的5个SNP位点在显性和隐性遗传模式下，基因型频率在肺TB亚组、肺外亚组和对照组间差异均无统计学意义(OR=0.737～1.326),重症TB亚组、非重症TB亚组和对照组间差异亦无统计学意义(OR=0.675～1.248)；P均>0.05。

3 讨论

基于Toll样受体TLR2基因及其信号通路在抗结核免疫中起着关键作用，为研究TLR2基因多态性与中国汉族儿童TB易感性的关联，本研究利用高通量Mass ARRAY平台，开展了病例对照研究。结果提示TLR2基因5个SNP位点基因型、等位基因在对照组和TB组及其亚组的分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。

目前有关TLR2 基因SNP位点和TB的易感性仅有Arg753Gln(rs5743708)和Arg677Trp(rs6265786)是关注的热点，土耳其、几内亚比绍、突尼斯以及中国人群的研究中均有相关报道。土耳其儿童的研究中，TB组纳入198例，结核潜伏感染(LTBI)组纳入200例，分层研究发现rs5743708的杂合型及Gln等位基因型频率在肺TB和肺外TB组中明显高于LTBI组[11]，提示rs5743708多态性与儿童TB易感相关[12]。几内亚比绍人群研究中，TB组321例，健康对照组347例，选取了包括rs5743708在内的TLR2,TLR4和TLR9基因上的5个SNP位点，结果显示rs5743708多态性与TB的易感并不相关[13]。突尼斯人群研究TB组33例(年龄20～75岁)，健康对照组33例(年龄22～50岁) ， 研究发现rs6265786的C/T杂合突变型在TB组(31例)明显高于对照组(10例)，且在TB组和对照组中均未发现纯合突变型(T/T)[14]。韩国人群研究中，结核样型麻风病组41例，瘤型麻风病组45例，健康对照组45例，选取TLR2基因启动子区SNP位点进行研究，结果显示突变型等位基因(C/T)仅出现在瘤型麻风病组中，结核样型麻风病组与健康对照组中均未检出，提示该突变可能是导致瘤型麻风病易感因素，但与TB易感没有相关性[15]。此外,Yim等研究位于TLR2内含子的微卫星多态性位点与韩国人群TB的易感性， TB组176例，健康对照196例，对TLR2基因的关键区域(启动子区、外显子、内含子、限制内切酶剪切位点、荧光素酶报告基因位点)选取了SNPs位点进行研究，结果发现TB组内含子区的GT重复最少，提示低GT重复可减弱TLR2基因启动子活性，从而导致易感TB[16]。中国东南部人群的研究显示，rs5743708 和rs6265786的突变非常罕见，并且与中国人群的TB易感并没有相关性[17]。

结合本研究未发现TLR2基因的5个SNP位点与TB易感呈现相关性，且不同国家、地区及种族的相关研究结论不尽一致，分析有如下几种可能：①TB的发生发展是由多个基因共同调控，本文所研究的TLR2基因的调控作用可能不占主导地位，其作用的发挥是在一个巨大的网络和通路中的多个基因共同协调的结果；②研究中不同种族的遗传差异性、研究样本量的大小和方法学的差异，可能导致研究结果出现差异；③一般认为儿童的免疫功能尚未完善，TB的发生及发展过程与成人存在一定差异，本文所研究的TLR2基因与儿童TB无相关性，未必不在成人TB中无相关性。

本文未发现TLR2基因多态性与汉族儿童TB易感的相关性，该基因及其SNP位点与TB的关系还需在后续的研究中进一步揭示。

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(本文编辑：丁俊杰)

Association between Polymorphisms of Toll like receptor 2 and the suseptibility to tuberculosis in Chinese Han children

XUFang1,3,XIELan-pin2,3,DONGYa-kun1,QIHui1,SUNLin1,LIJie-qiong1,XIAOJin1,JIAOWei-wei1,SHENChen1,SHENA-dong1

( 1KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045; 2HebeiKeyDisciplineofMedicalDevelopment,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050041,China; 3hasequalcontributiontothisstudy)

Corresponding Author：SHEN A-dong ，E-mail: shenad16@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Toll like receptor 2 (TLR2) gene and tuberculosis (TB) in Chinese Han children.Methods A case-control study was performed in TB patients obtained from pediatric patients with TB admitted to Beijing Children′s Hospital between February 2005 and October 2010, and other lung infection was excluded. TB patients were diagnosed as pulmonary TB (PTB) , extrapulmonary TB (EPTB), severe tuberculosis (SevTB) and non-severe tuberculosis (NonSevTB). Healthy controls were performed in health examination Chinese Han children, and TB infection was excluded. MassARRAY was used to find the difference of 5 SNPs ofTLR2 gene, including rs3804099 (allele C/T), rs1898830 (allele A/G), rs7656411 (allele G/T), rs11935252 (allele A/G), rs7696323 (allele C/T) and genotyping between TB group and the healthy control group. Then the difference of genotypes between TB and the control groups detected with dominant heredity model and recessive heredity model was analyzed.Results①TB group included 435 children, the mean age was 5.6 years(SD 4.7),male(n=219, 63.5%);PTB(n=151,43.81%),EPTB(n=194);sevTB(n=155,44.9%),NonsevTB(n=190).The control group enrolled 385 children with mean age 6.1(SD 3.8) years, males (n=226, 58.7%). Genotype frequen-cies of 5 SNPs in cases, controls and all subjects met Hardy-Weinberg equilibrium. No statistically significant differences in allelic and genotypic distributions of 5 SNPs were observed between TB and control groups(P=0.154-0.992). After adjustment by age and gender, the genotype of rs3804099 (TC,CC) and the frequency of allele C were found no statistical significance compared with the control group(0.929-1.071); rs1898830 (GA,GG) and the frequency of allele G were also found no significant difference compared with the control groups(OR=1.110-1.411); rs7656411 (GT,TT) and the frequency of allele T were found no statistical significance between TB and control group(OR=0.812-1.110)；rs11935252 (GA,GG) and the frequency of allele A were found no significant difference compared with the control group (OR=0.497-1.189) and rs7696323 (TT,CT) and the frequency of allele C were found no statistical significance compared with the control group (OR=0.888-1.034)(P>0.05) too. ② Neither in the dominant heredity model nor recessive heredity model, the genotype distribution of the 5 SNPs in cases group significantly differed from that in the control group, either in PTB subgroup or in EPTB subgroup (OR=0.737-1.326). And same results were found in sevTB and nonsevTB subgroups (OR=0.675-1.248),P>0.05.③No LD blocks were identified in the 5 SNPs′ ofTLR2.ConclusionSNPs ofTLR2 genes were not associated with TB suseptibility in Chinese Han children.

Tuberculosis； Children；TLR2 genes

1 儿科学国家重点学科，省部共建儿科重大疾病研究重点实验室，儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室，北京市儿科研究所，首都医科大学附属北京儿童医院 北京，100045；2 河北省医学重点发展学科，河北省胸科医院 石家庄，050041；3 共同第一作者

申阿东，E-mail: shenad16@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.06.008

2014-10-13

2014-11-27)