长链多不饱和脂肪酸对高糖环境下视网膜细胞生长的影响及其机理研究

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(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014;2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058)

糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是一种糖尿病微血管并发症，带给患者极大的痛苦.同时，DR也是当前人类致盲的主要原因之一，且发病人数以每年15%的速度递增[1-2]，而糖尿病患者随着病情加深其失明的可能性是普通人的25～30倍.DR的发病机理目前仍不清楚，可能与高糖导致的一系列功能和生化代谢异常有关.以往研究认为，导致DR的原因包括：血液流变学异常[3]，多元醇通路活化[4]，氧化应激增多[5-6]，晚期糖基化终产物积聚[7]，细胞因子活化以及基因影响等[8-9].脂肪酸是视网膜的主要组分，其组成变化是包括糖尿病视网膜病变在内的多种视网膜病变发生和发展的原因和基础，已有研究表明高血脂将提高糖尿病人视网膜病变的发病率.而视网膜中n-3/n-6长链多不饱和脂肪酸的比例发生改变也与多种视网膜病变的发生和发展有关.

现代研究认为，炎性因子的表达与糖尿病视网膜病变发生发展有密切关系.白介素6(Interleukin 6，IL-6)是一种促炎性因子，可以引起急性炎症反应并且增加血管通透性[10].IL-6已被证明可以通过诱导血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达有效促进血管新生[10-11].也有实验证明IL-6表达的水平与DR的严重程度呈正相关[12-13].VEGF是最直接的眼球内新生血管生长因子，在高血糖环境中，视网膜及相关组织处于缺氧状态，可刺激VEGF的表达，而VEGF则促进新血管形成，并改变血管通透性的能力[14].John PS等[15]对长链多不饱和脂肪酸影响视网膜健康与病变做了全面的综述，他们认为n-3长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)，特别是DHA是视网膜的重要组成部分，影响着视网膜的健康和功能.同时，PUFAs对炎性因子及VEGF表达有显著影响，EPA可以有效抑制VEGF特异性酪氨酸激酶受体的激活及表达.在前人研究的基础上，笔者着重探索了PUFAs对糖尿病视网膜病变的影响，通过构建RF/6A细胞高糖逆境模型，研究了AA，EPA及DHA三种长链多不饱和脂肪酸对高糖环境下诱导的RF/6A细胞过度增殖的影响，并通过分析高糖环境对PUFAs吸收的影响，RF/6A细胞脂肪酸组成以及IL-6和VEGF表达水平的变化，以期揭示PUFAs对糖尿病视网膜病变的影响及其作用机制，为后续糖尿病视网膜病变防治药物的开发和探索提供新的实验和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材 料

RF/6A购买自中国科学院细胞库；胎牛血清购买自杭州四季青生物工程材料有限公司；高糖DMEM培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶和牛血清白蛋白购自上海生物工程有限公司；青霉素及链霉素购自杭州红会医院；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)购自美国Sigma公司.

1.2 RF/6A细胞培养

RF/6A细胞培养于高糖DMEM培养液，pH 7.2.培养液中添加10%已灭活胎牛血清和双抗(青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL).细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，48 h换液，每72 h传代一次.细胞培养及分析用容器彻底清洗后用124 ℃湿热灭菌30 min.

1.3 脂肪酸样品的配制

将AA，EPA,DHA样品溶解于无水乙醇中并经0.22 μm滤膜过滤除菌配制成浓度为20 mmol/L的储备液，-20 ℃储存.将PUFAs的储备液用含有无脂肪酸牛血清白蛋白的无血清培养液稀释至60～200 μmol/L.BSA将被作为PUFAs的载体，脂肪酸与其的摩尔比维持在5∶1[16].

1.4 MTT分析

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)[17]分析是测试细胞存活率和代谢能力的一种常规手段.该方法主要是因为黄色的MTT可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素c代谢生成蓝色不溶于水的甲臜(Formazan).甲臜可以溶于DMSO中并通过酶标仪在550 nm波长处测定光密度OD值.而死细胞则不能生成甲臜.MTT的配制：称取MTT以5 mg/mL的浓度溶于磷酸缓冲溶液(Phosphate buffer solution，PBS)，经0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃储存备用.将处于对数生长期的RF/6A细胞接种于96孔板，细胞密度为104个/孔，培养24 h后，换液并加入一定浓度的处理试剂，每组设8个平行，对照孔加入培养液，继续培养一定时间后.取出96孔板并甩出孔内培养液，加入20 μL的MTT，放入培养箱中培养3 h，之后取出加入150 μL DMSO，用水平振荡器使孔内甲臜完全溶解，然后用酶标仪在550 nm处OD值.存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%.

1.5 细胞脂肪酸组分测定

将处于对数生长期的RF/6A细胞接种于细胞瓶中用含有体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，细胞密度为3×105个/瓶.培养24 h后，吸出以前的培养液，每瓶加入5 700 μL含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和300 μL的处理试剂.培育结束以后，用胰酶消化离心收集，用PBS冲洗两遍后转入离心管中快速加入体积分数为5%盐酸甲醇3 mL，立即密封放入100 ℃恒温箱中，反应3 h，然后取出冷却至室温，加入等体积的高纯水，用3 mL正己烷分三次萃取，回收正己烷相，用无水硫酸钠除水并经0.22 μm滤膜过滤，氮气吹干，用正己烷定容至100 μL并进样至安捷伦气相色谱(Agilent 7890A)，色谱柱为DB-23(0.25 mm，60 m).程序升温条件：130 ℃保留1 min，6.5 ℃/min升至180 ℃，然后2.5 ℃/min升至225 ℃并保持10 min.

1.6 VEGF和IL-6的检测

将处于对数生长期的RF/6A细胞接种于六孔板瓶中用含有体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，细胞密度为2×105个/瓶.培养24 h后，吸出以前的培养液，每瓶加入3 800 μL含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和200 μL的处理试剂.培养结束以后将培养液分装到离心管中密封储存于-20 ℃冰箱中备用.利用市面上可以购买到的猴源VEGF和IL-6 ELISA试剂盒来检测培养液中由细胞所表达的VEGF和IL-6的水平，分别按照其试剂盒说明书操作，最后在酶标仪中以450 nm波长检测吸光度.

1.7 数据统计分析

数据统计分析采用t-test和SPSS 14.0进行，绘图采用Microsoft Excel 2003进行，数值表示为平均值±SD.

2 结果与讨论

2.1 高浓度葡萄糖对RF/6A细胞生长的影响

选用40，50，60，70 mmol/L浓度的D-葡萄糖处理RF/6A细胞，采用MTT法测定细胞存活率.由图1可知：作用72 h，50 mmol/L及60 mmol/L葡萄糖处理能诱导RF/6A细胞大量增殖(**为p<0.01)，而70 mmol/L葡萄糖处理，RF/6A细胞存活率有下降趋势，较对照无显著性差异，故选择60 mmol/L葡萄糖处理构建高糖模型.同时，由图2可知：40～70 mmol/L甘露醇处理对RF/6A细胞生长无影响，说明高糖诱导的RF/6A细胞存活率变化与渗透压无关.

图1 葡萄糖处理72 h对RF/6A细胞存活率的影响

图2 不同浓度甘露醇作用72 h对存活率的影响

2.2 长链多不饱和脂肪酸对高糖环境下RF/6A细胞生长的影响

采用120，140，160，180，200 μmol/L浓度的AA，EPA及DHA处理高糖环境下的RF/6A细胞，图3显示，高糖与PUFAs共同处理下，随着PUFAs浓度的升高，RF/6A细胞存活率先升高后降低.AA浓度为180 μmol/L可显著抑制高糖诱导的细胞增殖，其存活率与空白细胞无显著性差异；EPA浓度为160 μmol/L时可显著抑制高糖诱导的细胞增殖；200 μmol/L DHA处理可显著抑制高糖诱导的细胞增殖.因此，本实验选择180 μmol/L AA，160 μmol/L EPA及200 μmol/L DHA用于后续研究.

2.3 长链多不饱和脂肪酸及高浓度葡萄糖对RF/6A细胞脂肪酸组成的影响

采用葡萄糖及PUFAs处理RF/6A细胞，并采用气相色谱测定不同处理RF/6A细胞脂肪酸组成.由表1,2可知：高糖处理的RF/6A细胞，细胞培养基中无添加脂肪酸的情况下，脂肪酸组成较空白对照组变化不明显；AA，EPA及DHA处理均能改变RF/6A细胞脂肪酸组成.同时，AA处理RF/6A细胞，细胞中AA的质量分数显著升高(45.29%)，而AA与高糖同时处理，则AA含量较AA单独处理组高(63.24%)，说明高糖环境促进了RF/6A细胞对AA的吸收.EPA和DHA单独处理RF/6A细胞，分别使细胞中EPA和DHA含量升高(EPA=8.26%；DHA=14.87%)；而高糖环境下，EPA和DHA单独处理后，RF/6A细胞中EPA和DHA含量较单独EPA、DHA处理降低(EPA的质量分数为6.20%；DHA的质量分数为8.92%)，则说明高糖环境抑制了RF/6A细胞对EPA和DHA的吸收.由此，高糖环境可改变视网膜细胞对不同种类脂肪酸的吸收，这可能是高血糖导致视网膜脂肪酸组成变化的重要机制.

1—空白对照组；2—60 mmol/L葡萄糖模型组；3—120 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖处理组；4—140 μmol/L 脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖处理组；5—160 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖处理组；6—180 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖处理组；7—200 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖处理组；*为p<0.05;** 为p<0.01

表1 PUFAs和葡萄糖处理的RF/6A细胞的脂肪酸组分1)

表2 高浓度葡萄糖及PUFAs对RF/6A细胞S/U及n-6/n-3比例的影响1)

采用n-6长链多不饱和脂肪酸AA处理RF/6A细胞，细胞中n-3脂肪酸含量显著升高，而n-6脂肪酸含量较空白及高糖处理降低；而在高糖环境下，采用AA处理，RF/6A细胞中n-6脂肪酸含量显著提高，可达80.35%.采用EPA处理，RF/6A细胞中n-3脂肪酸含量显著提高，而高糖环境下，EPA处理则使RF/6A细胞中n-6脂肪酸含量升高，而n-3脂肪酸含量较EPA单独处理时降低.同时，采用DHA处理，RF/6A细胞中n-3脂肪酸含量显著提高，在高糖环境下，n-3及n-6脂肪酸含量均明显降低，而n-9及SFA含量提高.由此，高糖环境不仅影响RF/6A细胞对脂肪酸的吸收，也影响RF/6A细胞脂肪酸代谢.另一方面，本实验结果也表明三种长链多不饱和脂肪酸处理对RF/6A细胞脂肪酸组成有影响.

2.4 长链多不饱和脂肪酸及高浓度葡萄糖对RF/6A细胞VEGF及IL-6表达的影响

由图4可知：高糖处理下，RF/6A细胞中IL-6浓度提高；AA处理对高糖诱导的IL-6表达有促进作用.而采用EPA及DHA处理后，IL-6浓度较高糖处理显著降低，与空白对照无显著性差异，表明两种n-3长链多不饱和脂肪酸对高糖诱导的IL-6表达具有抑制作用.

1—空白对照组；2—60 mmol/L葡萄糖模型组；3—180 μmol/L AA和60 mmol/L葡萄糖处理组；4—160 μmol/L EPA和60 mmol/L葡萄糖处理组；5—200 μmol/L DHA和60 mmol/L葡萄糖处理组；*为p<0.05;**为p<0.01

由图4可知：高糖处理下，RF/6A细胞中VEGF浓度升高，但与空白对照组无显著性差异；而采用三种长链多不饱和脂肪酸处理后，VEGF含量较高糖处理升高，特别是AA及EPA对VEGF表达具有显著促进作用，而DHA处理VEGF浓度较对照组无显著性差异.

由此，高浓度葡萄糖显著促进IL-6表达，可能是糖尿病视网膜病变的重要机制；高糖环境下，AA处理促进了IL-6及VEGF表达；EPA处理能显著抑制IL-6表达，但对VEGF表达有促进作用；DHA处理可显著抑制高糖诱导的IL-6表达，对VEGF表达无显著性促进作用.由此，DHA在糖尿病视网膜病变的防治方面更具开发潜力，而其作用机制仍值得进一步探索.

3 结 论

糖尿病视网膜病变一般分为两个阶段.第一个阶段为非增殖性糖尿病视网膜病变，其特点是黄斑水肿，微小血管瘤等.第二个阶段为增殖性糖尿病视网膜病变，其特点是有大量的新生血管形成，并极易造成视网膜脱落.不论是前期还是后期，内皮细胞都表现为增殖.因此抑制内皮细胞在高糖环境下增殖就成为相关药物筛选的主要指标.实验结果表明：180 μmol/L AA，160 μmol/L EPA及200 μmol/L DHA可显著抑制高糖诱导的细胞增殖.值得注意的是，三种长链多不饱和脂肪酸对RF/6A细胞增殖影响的结果背后存在不同的机理.气相色谱检测结果发现，三种长链多不饱和脂肪酸处理对RF/6A细胞脂肪酸组成和代谢的影响不同.采用VEGF和IL-6 ELISA试剂盒检测其结果则显示，高糖环境下，AA处理组IL-6及VEGF含量均达到最高，这可能是因为在高糖胁迫的细胞模型中加入AA，可以刺激n-6脂肪酸的转化和集聚.同时，AA又大量转化成其他促炎分子，导致了大量的VEGF和IL-6的表达，而炎性因子的大量表达促使细胞凋亡，所以得到了180 μmol/L AA处理组细胞增殖被抑制的情况.EPA处理后，细胞中的EPA部分转化为抗炎分子，部分转化为促炎分子，因此其可抑制IL-6表达，但对VEGF表达有一定的促进作用.DHA处理后，细胞中的DHA并不能直接转化为促炎分子，但可转化为抗炎分子，因此其对IL-6表达具有良好的抑制作用，对VEGF不表现促进作用.总体上，三种长链多不饱和脂肪酸处理，DHA对高糖诱导的视网膜细胞增殖具有最好的效果，值得进一步深入探索.

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